Mapping and characterization of resistance to downy mildew in an East Asian grapevine genetic resources

英语. Downy mildew of grapevines is one of the most destructive diseases caused by an obligate biotrophic oomycete Plasmopara viticola, triggering severe yield loss. Regular applications of fungicides are necessary to prevent such losses, but this leads to severe environmental issues and decreased social acceptance. As a potential equivalent to traditional downy mildew management strategies, cultivars with durable resistance could contribute to sustainable and environmentally friendly viticulture. It is, therefore, common for grapevine breeders to develop fungus-resistant varieties utilizing naturally occurring resistance from wild species. Therefore, the primary breeding goal is to identify new resistances with different defence mechanisms and stack them in new varieties to prevent disease outbreaks and resistance-breaking isolates, thus minimizing fungicides in viticulture. Heretofore, more than 30 resistance loci against P. viticola have been already discovered. In this study, the bi-parental F1 population (‘Morio Muskat’ x COxGT2 (V. coignetiae x ’Gewürztraminer’)) Gf.2018-063 was investigated to identify and map resistance to P. viticola. The source of resistance is the East Asian wild species Vitis coignetiae. In addition to 109 simple sequence repeats (SSR) markers, 647 transferrable RNase H2-dependent amplicon sequencing (rhAmpSeq) markers are implemented in the creation of a genetic map. The resulting high-resolution rhAmpSeq map spanned a total map length of 1147.36 cM, comprising 19 linkage groups and an average distance between loci of 3.2 cM. Using each linkage map separately and three years of leaf disc assay based phenotypic data, quantitative trait locus (QTL) analysis was performed resulting in a consistent and highly significant QTL on chromosome 14 with an explained phenotypic variance of up to 36.4 %. This QTL does not share any SSR marker alleles with the pre-existing East Asian V. amurensis derived Rpv8 and Rpv12 QTLs on chr. 14. Therefore, it was designated as Rpv32 (Resistance Plasmopara viticola 32) (Malagol et al., 2023, in preparation). SSR and rhAmpSeq markers identified in this research work can be exploited in Marker-assisted selection (MAS) for introgression of Rpv32 into breeding lines and stacking resistances. Furthermore, microscopic staining studies at various time intervals and quantitative analysis of P. viticola (5 dpi) demonstrated and confirmed that the genetically identified resistant parental genotype (COxGT2), in contrary to the second parental genotype (‘Morio Muskat’), prevents pathogen proliferation. Moreover, the population utilized in this study showed segregation for the morphological trait leaf hair and a significant QTL was identified on LG 5 with an explained variance of 24 % (ribbon trichome). The hypothesis that leaf hair serves as physical barrier against P. viticola was tested in all three years. However, no strong association was observed between the leaf hair density and P. viticola infection on the leaf discs. When different people work on phenotypic data evaluation in various years, traditional phenotyping methodologies turn out not only to be time-consuming and labor-intensive, but also immensely subjective. This subjectivity tends to introduce statistical noise and bias into the final analytical result. Therefore, this research also focused on training and developing a high-throughput SCNN (shallow convolutional neural network) based model for downy mildew disease quantification (Zendler et al., 2021). The model achieved an overall prediction accuracy of 97 %. The SCNN model performance was demonstrated by a strong and significant correlation with independently evaluated experts’ data. This SCNN model in combination with an automated imaging system, shows accuracy and potential reduction in time spent on phenotyping. This pipeline serves as a valuable tool in grapevine breeding research. As an additional aspect of this research, a Residual Networks-based Convolutional Neural Network (ResNet-CNN) for leaf hair quantification was developed due to the lack of accurate and precise tools available (Malagol et al., 2023, in preparation). The model achieved an overall prediction accuracy of 95.41 %. The validation and cross validation with two expert and two non-experts showed exceptional correlation (R = 0.98 and R = 0.92, RMSE 8.20 and 14.18, respectively). The absolute errors calculated clearly indicated bias introduced due to the subjectivity. To conclude, the developed ResNet-CNN is capable of enhancing objective phenotyping accuracy for leaf hair density, allowing for a more precise analysis of this trait (refer to Annex III & Annex IV).

德语. Der Falsche Mehltau der Rebe, der durch den obligat biotrophen Oomyceten Plasmopara viticola verursacht wird, gehört zu den gefährlichsten Erkrankungen der Rebe, da er zu erheblichen Ertragsverlusten führen kann. Der regelmäßige Einsatz von Fungiziden ist notwendig, um Ertragseinbußen zu verhindern, führt aber zu nachteiligen Umweltauswirkungen und geht einher mit einer geringen gesellschaftlichen Akzeptanz. Resistente Rebsorten können eine Ergänzung zu den herkömmlichen Strategien in der Bekämpfung des Falschen Mehltaus darstellen und zu einem nachhaltigen und umweltfreundlichen Weinbau beitragen, indem durch ihre Nutzung die Ausbringung von Pflanzenschutzmitteln drastisch reduziert werden kann. Daher ist es naheliegend, dass die Rebenzüchtung den Fokus auf pilzresistente Sorten legt und dabei natürlich vorkommende Resistenzen von Wildarten der Rebe nutzt. Die primären Zuchtziele sind daher die Identifizierung neuer Resistenzen mit unterschiedlichen Abwehrmechanismen, um einen Krankheitsausbruch und resistenzbrechende Isolate zu verhindern. Bis heute wurden mehr als 30 Resistenzloci gegen P. viticola identifiziert. In dieser Studie wurde die bi-parentale F1-Population ('Morio Muskat' x COxGT2 (V. coignetiae x 'Gewürztraminer')) Gf.2018-063 untersucht, um Resistenzen gegen P. viticola zu identifizieren und zu kartieren. Als Resistenzquelle diente die bisher ungenutzte ostasiatische Wildart Vitis coignetiae. Es wurde eine genetische Karte basierend auf 109 simple sequence repeats (SSR)-Markern erstellt sowie eine weitere genetische Karte mit 647 Markern auf Grundlage der RNase-H2-abhängigen Amplikon-Sequenzierung (rhAmpSeq). Die daraus resultierende hochauflösende rhAmpSeq-Karte umfasst eine Gesamtlänge von 1147,36 cM, mit 19 Kopplungsgruppen und einem durchschnittlichen Abstand zwischen den Loci von 3,2 cM. Die phänotypischen Daten (Blattscheiben-Test) wurden über drei Jahre erhoben und in Quantitative Trait Locus (QTL)-Analysen unter Verwendung jeder einzelnen Kopplungskarte eingesetzt. Es konnte ein konsistenter und hoch signifikanter QTL auf Chromosom 14, mit einer erklärten phänotypischen Varianz von bis zu 36,4 % ermittelt werden. Dieser QTL teilt keine SSR-Markerallele mit den bereits existierenden, von V. amurensis abgeleiteten, QTLs Rpv8 und Rpv12 auf Chr. 14. Daher wurde er als Rpv32 (Resistenz Plasmopara viticola 32) bezeichnet (Malagol et al., 2023, in Vorbereitung). SSR- und rhAmpSeq-Marker, die in dieser Forschungsarbeit identifiziert wurden, können in der markergestützten Selektion für die Introgression von Rpv32 in Zuchtlinien und die Pyramidisierung von Resistenzen genutzt werden. Darüber hinaus zeigen und bestätigen mikroskopische Färbungsstudien in verschiedenen Zeitintervallen und quantitative Analysen von P. viticola (5 dpi), dass der resistente parentale Genotyp (COxGT2) im Gegensatz zum anfälligen Genotyp ('Morio Muskat') die Vermehrung des Pathogens verhindert. Weiterhin zeigt die in dieser Studie verwendete Population eine Segregation für das morphologische Merkmal Blattbehaarung, für das ein signifikanter QTL auf Chr. 5 mit einer erklärten Varianz von 24 % (ribbon trichome) identifiziert wurde. Die Hypothese, dass die Blattbehaarung als physische Barriere gegen P. viticola dient, wurde in allen Jahren analysiert. Jedoch wurde kein Zusammenhang zwischen der Dichte der Blatthaare und dem Befall der Blattscheiben mit P. viticola im vorliegenden Fall festgestellt. Herkömmliche Methoden der Phänotypisierung sind sowohl zeit- und arbeitsintensiv, als auch subjektiv, wenn unterschiedliche Personen solche Daten erheben. Diese Subjektivität kann zu statistischem Rauschen und zu Verzerrungen im Ergebnis führen. Daher konzentrierte sich die vorliegende Forschungsarbeit zusätzlich auf das Training und die Entwicklung eines auf künstlicher Intelligenz (SCNN: Shallow convolutional neural network) basierenden Hochdurchsatzmodells zur Quantifizierung der Resistenzeigenschaften gegen den Erreger des Falschen Mehltaus (Zendler et al., 2021). Das Modell erreicht eine Gesamtvorhersagegenauigkeit von 97 %. Die Leistung des SCNN-Modells wurde durch eine hohe und signifikante Korrelation mit den Daten von unabhängig bewertenden Experten nachgewiesen. Dieses SCNN-Modell, in Kombination mit einem automatisierten Bildgebungssystem, bietet eine hohe Genauigkeit und verringert den Zeitaufwand für die Phänotypisierung. Die Pipeline ist daher ein wertvolles Instrument für die Forschung in der Rebenzüchtung. Als zusätzlicher Aspekt dieser Arbeiten wurde ein auf Convolutional Neural Network (ResNet-CNN) basierendes Analysemodell für die Quantifizierung von Blatthaaren entwickelt, da bisher keine genauen und präzisen Werkzeuge zu deren Phänotypisierung zur Verfügung standen (Malagol et al., 2023, in Vorbereitung). Die Gesamtvorhersagegenauigkeit des Modells beträgt 95,41 %. Die Validierung und die Kreuzvalidierung mit zwei Experten und zwei Nicht-Experten zeigten eine außergewöhnliche Korrelation (R = 0,98 und R = 0,92, RMSE 8,20 bzw. 14,18). Die berechneten absoluten Fehler weisen eindeutig auf eine durch die Subjektivität bedingte Verzerrung hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entwickelte ResNet-CNN in der XIII Lage ist, die objektive Phänotypisierungsgenauigkeit für das Merkmal „Dichte der Blatthaare“ zu verbessern und eine präzisere Analyse des Merkmals zu ermöglichen (Annex III & Annex IV). Damit steht ein neues Werkzeug zur Verfügung, das die Voraussetzungen für die genetische Analyse der Dichte der Blattbehaarung als physische Barriere gegen P. viticola schafft.