Study of the effect of colonisation of neonates by genotoxic Escherichia coli strains on the development and functionality of the intestinal barrier | Etude de l'effet de la colonisation des nouveau-nés par des souches de Escherichia coli génotoxiques sur le développement et la fonctionnalité de la barrière intestinale

英语. During early development, intestinal microbiota intimately interacts with the hostgastrointestinal (GI) tract and modulates epithelial cell differentiation and immune system maturation.Escherichia coli is one of the first bacteria colonizing the GI tract of mammals and humans within afew days after birth and become the predominant facultative anaerobic bacteria in the adult microbiota.Certain commensal E. coli are able to induce DNA damage in eukaryotic cells. Genotoxicity of suchE. coli strains is known to result from Colibactin synthesis, an hybrid peptide polyketide product ableto induce DNA double strand breaks in enterocytes. The biosynthesis pathway of Colibactin isencoded by a genomic island called pks. Several recent epidemiologic studies showed that more thirtyper cent of three days old infants are colonized by E. coli pks+. To analyze the long-term effects ofcolonization early in life by genotoxic E. coli strains, we developed an animal model that mimics thenatural transmission of E. coli from the mother' to the neonate through direct contact with the maternalmicrobiota. Pregnant WISTAR rats were fed with a human genotoxic wild-type commensal E. coli (E.coli WT), an isogenic non-genotoxic mutant (E. coli ∆clbA), or an isogenic complemented mutant (E.coli ∆clbA+clbA) for which genotoxicity was restored. After delivery, pups’ colonization and DNA-damages in enterocytes were monitored during 100 days. In addition, we analyzed gut developmentand maturation over the same period.E. coli strains, producing or not Colibactin, were transmitted tothe offspring and stably colonized the gut. DNA double strand breaks (DSBs) were observed inenterocytes of newborn rats colonized by E. coli WT or E. coli ∆clbA+clbA complemented strain butwere absent in newborn rats colonized by E. coli ∆clbA mutant. Interestingly, such genotoxicity wasnot detected in adults but mitotic cells present signs of DSBs’ persistence with an increased number ofanaphasic bridges in adult animals colonized since birth by genotoxic strains. The numbers ofproliferating and apoptotic cells were also significantly increased in the intestinal crypts of ratsexposed to genotoxic E. coli strains as compared to non-genotoxic E. coli ∆clbA mutant and this wascorrelated with an increase of intestinal epithelial cells migration along the crypt-villus axis in ratscolonized with the genotoxic E. coli strains. In addition, the numbers of enteroendocrines cells andPaneth cells were increased in small intestine of the same animals. Finally, ex-vivo analysis of theintestinal barrier using Ussing chambers demonstrated that paracellular permeability to 4kDa dextran-FITC flux was increased in rats colonized by the genotoxic E. coli strains as compared to ratscolonized by the isogenic non-genotoxic ∆clbA mutant.The genotoxicity of commensal E. coli colonizing the newborns has long-lasting consequenceson intestinal epithelium integrity, development and maturation at adulthood. These bacteria could beof major concerns since they are increasingly isolated from neonates in Europe and the USA.

法语. Au cours du développement post-natal, le microbiote intestinal interagit intimement avec l’hôte et module à la fois la différenciation de l’épithélium intestinal et la maturation du système immunitaire. Hôte commun de la microflore commensale intestinale de l’Homme et des animaux à sang chaud, Escherichia coli (E. coli) s’établit dans le tractus digestif dès les premières heures ou jours qui suivent la naissance. E. coli est alors une des espèces bactériennes dominantes de la flore du nouveau-né avant de devenir la bactérie aérobie facultative prédominante au sein du microbiote adulte. Certaines souches commensales de E. coli sont capables d’induire des dommages à l’ADN dans les entérocytes. La génotoxicité de ces souches résulte de la production d’une toxine, la colibactine, synthétisée à partir de synthèses de polycétides et de peptides non ribosomaux. Cette voie de biosynthèse est codée par un îlot génomique appelé pks. Plusieurs études épidémiologiques récentes montrent que plus de 30% des jeunes enfants âgés de trois jours sont colonisés par des E. coli qui portent l’îlot pks.Afin d’analyser les effets à long terme de la colonisation précoce des nouveau-nés par des souches de E. coli génotoxiques, nous avons développé un modèle animal expérimental qui mime la transmission naturelle des E. coli du microbiote de la mère au nouveau-né. Pour cela, des femelles rats gestantes sont gavées avec une souche commensale humaine génotoxique (E. coli WT), son mutant isogénique (E. coli ΔclbA) ou le mutant complémenté (E. coli ΔclbA+clbA) pour lequel la production de la colibactine a été restaurée. Après la naissance, la transmission des souches bactériennes et la persistance de la colonisation chez les nouveau-nés ont été évaluées. En parallèle, les dommages à l’ADN occasionnés par ces souches sur l’épithélium intestinal ont été comparés sur une période de 100 jours. Enfin, le développement et la maturation de l’épithélium intestinal ainsi que sa fonction de barrière ont été analysés sur cette même période.Les souches de E. coli, produisant ou non la colibactine, sont transmises à la descendance et colonisent de manière stable le tractus digestif tout au long de la vie de l’animal. Dès le deuxième jour après la naissance, des cassures double-brin de l’ADN (CDB) ont été observées dans les entérocytes des ratons colonisés par la souche de E. coli WT ou E. coli ΔclbA+clbA complémentée mais sont absentes chez les nouveau-nés colonisés par le mutant E. coli ΔclbA. Si de manière surprenante, aucune CDB n’a été détectée chez ces rats devenus adultes (100 jours), une fraction des cellules en mitose présente en revanche des signes de persistance des CDB : des ponts anaphasiques sont observés chez les animaux adultes colonisés par des souches génotoxiques. L’étude des conséquences du portage à long terme de souches génotoxiques sur le développement de l’épithélium intestinal, a révélé une augmentation significative de la prolifération et de l’apoptose des entérocytes corrélée avec une augmentation de la vitesse de migration de ces cellules épithéliales le long de l’axe crypte-villosité chez les animaux exposés à des souches génotoxiques depuis la naissance. De plus, une augmentation du nombre des cellules entéroendocrines et des cellules de Paneth a été constatée chez ces mêmes animaux. Les répercussions des perturbations précédemment observées sur la fonction de la barrière intestinale ont été analysées ex vivo en chambres de Ussing et montrent une augmentation de la perméabilité intestinale chez les rats colonisés depuis la naissance par des souches génotoxiques en comparaison à des animaux colonisés par le mutant non génotoxique.Ainsi la colonisation du nouveau-né par des E. coli génotoxiques altère non seulement le développement et la maturation de l’épithélium intestinal à l’âge adulte mais également son intégrité. Ces modifications ont clairement des conséquences physiopathologiques pour l’hôte qui dépassent une prédisposition au développement de cancers colorectaux.