PL: Chemoenzymatyczne metody otrzymywania biologicznie aktywnych fosfolipidów zawierających O-metylowane kwasy fenolowe | EN: Chemoenzymatic methods of obtaining biologically active phospholipids containing O-methylated phenolic acids

abstractPL: Praca doktorska została przygotowana w oparciu o monotematyczny cykl trzech artykułów opublikowanych w renomowanych czasopismach o zasięgu międzynarodowym, które dotyczą metod otrzymywania biologicznie aktywnych fosfolipidów, zawierających w swojej strukturze O-metylowane pochodne kwasów fenolowych. Celem realizowanej przez mgr inż. Martę Okulus pracy doktorskiej było opracowanie chemoenzymatycznych metod otrzymywania fosfatydylocholin, zawierających w pozycji sn-1 i/lub sn-2 wybrane, naturalne kwasy aromatyczne takie jak: kwas anyżowy (ANISA), weratrowy (VA), cynamonowy (CA) i 3-metoksycynamonowy (3-OMe-CA). Pracę podzielono na dwa etapy. Pierwszy z nich polegał na uzyskaniu w/w koniugatów na drodze syntezy chemicznej. W drugim etapie skupiono uwagę na opracowaniu enzymatycznej metody otrzymywania fosfolipidów, zawierających wspomniane pochodne kwasu benzoesowego w niepolarnym regionie fosfatydylocholiny. W wyniku syntezy chemicznej uzyskano serię 16 nowych fosfatydylocholin z dobrymi wydajnościami rzędu od 14% do 94%, których sposób otrzymywania został zgłoszony do ochrony patentowej, a aktywność antyproliferacyjna względem wybranych linii komórek nowotworowych została zbadana w zespole prof. Joanny Wietrzyk w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda PAN we Wrocławiu. W testach aktywności antyproliferacyjnej udowodniono, że prawie wszystkie zsyntezowane związki wykazują wyższą aktywność w stosunku do wolnych form kwasów i co jest szczególnie istotne z praktycznego punktu widzenia, ich działanie jest selektywne względem komórek nowotworowych. Przy wyznaczonych dawkach cytotoksycznych, koniugaty te pozostają nietoksyczne względem komórek z niezaburzonym procesem proliferacji. W grupie badanych związków najsilniejsze działanie wykazała 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (VA-LPC), która hamowała proliferację komórek nowotworowych ludzkiej białaczki (IC50=9,52 μM), raka piersi (IC50=20,7 μM) i okrężnicy (IC50=16,7 μM) odpowiednio przy dawkach ponad 38-, 28- i 19-krotnie niższych od tych wyznaczonych dla kwasu weratrowego. Aktywna względem komórek tych samych linii nowotworowych okazała się również fosfatydylocholina, zawierająca w pozycji sn-1 kwas anyżowy (ANISA-LPC). Przy dawkach IC50 w zakresie od 21,1 do 48,4 μM efektywnie hamowała proliferację komórek nowotworowych, będąc od 7 do 12 razy bardziej aktywna od wolnej formy tego kwasu. W toku badań prowadzonych względem opornych na doksorubicynę komórek raka okrężnicy (LoVo/DX) wykazano także, że wszystkie badane koniugaty są w stanie przezwyciężać lekooporność komórek nowotworowych tej linii. Natomiast na podstawie analizy wyników uzyskanych w trakcie badania mechanizmów działania trzech najbardziej aktywnych koniugatów względem komórek białaczki linii MV4-11 stwierdzono, że 1-anyżoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (1-ANISA-LPC) i 1-palmitoilo-2-cynamoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (1-PA-2-CA-PC) działają jako cytostatyki, podczas gdy 1-weratroilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina (1-VA-LPC) pełni rolę czynnika cytotoksycznego. Ze względu na obiecujące wyniki badań in vitro, w drugim etapie pracy doktorskiej, podjęto próbę opracowania enzymatycznego procesu otrzymywania fosfolipidowych pochodnych kwasu anyżowego i weratrowego na drodze jednoetapowej reakcji acydolizy naturalnej fosfatydylocholiny wyizolowanej z żółtka jaja kurzego, katalizowanej przez komercyjnie dostępne lipazy selektywne względem pozycji sn-1 fosfolipidów. Badania na tym etapie obejmowały dobór i optymalizację podstawowych parametrów takich jak rodzaj biokatalizatora, środowisko reakcji, stosunek molowy reagentów, zawartość enzymu, temperatura oraz czas reakcji. W przypadku modyfikacji naturalnej fosfatydylocholiny kwasem anyżowym, jako główny produkt reakcji acydolizy katalizowanej z udziałem lipazy z Candida antarctica (Novozym 435), uzyskano anyżoilo-2-lizofosfatydylocholinę (ANISA-LPC) z 28,5% wydajnością izolowania przy zoptymalizowanych parametrach, prowadząc reakcje przez 72 h w dwuskładnikowym układzie rozpuszczalników, będącym mieszaniną toluenu i chloroformu (9:1, v/v) oraz stosując 30% wagowych enzymu, stosunek molowy substratów PC:ANISA 1:15 i temperaturę 50C. Próba enzymatycznej inkorporacji kwasu weratrowego w strukturę fosfatydylocholiny nie powiodła się. Fakt ten wytłumaczyć można hamującym wpływem obecności dwóch grup metoksylowych w pierścieniu aromatycznym cząsteczki kwasu, co stanowi przestrzenną barierę mającą istotny wpływ na przebieg enzymatycznej reakcji acydolizy. Mając na uwadze potwierdzony w testach in vitro potencjał antynowotworowy fosfolipidowych pochodnych wybranych kwasów aromatycznych oraz wykazaną na przykładzie fosfolipidowych pochodnych kwasu anyżowego możliwość ich otrzymywania w łagodniejszych warunkach, w efekcie procesu enzymatycznego, można stwierdzić, że uzyskane wyniki stanowią cenny wkład w zapoczątkowany w zespole nurt badań nad otrzymywaniem tego typu połączeń, które mogłyby znaleźć w przyszłości praktyczne zastosowanie jako nutraceutyki o aktywności chemoprewencyjnej lub środki wspomagające klasyczną terapię przeciwnowotworową.

abstractEN: The doctoral thesis was prepared on the basis of a monothematic series of three articles published in renowned international journals, which concern the methods of obtaining biologically active phospholipids containing O-methylated derivatives of phenolic acids in their structure. The aim of the work was to develop methods of preparation of phosphatidylcholines, containing in sn-1 and/or sn-2 positions selected aromatic acids such as: anisic acid (ANISA), veratric acid (VA), cinnamic acid (CA) and 3-methoxycinnamic acid (3-OMe-CA). The work was divided into two stages. The first one consisted in obtaining the above mentioned conjugates by chemical synthesis. In the second stage the attention was focused on development of enzymatic method of production of phospholipids containing the mentioned derivatives of benzoic acid in non-polar region of phosphatidylcholine. As a result of chemical synthesis, a series of 16 new phosphatidylcholines in good yields ranging from 14 to 94% were obtained, which the method of preparations has been applied for patent protection, and their antiproliferative activity against selected cancer cell lines has been tested in the team of Prof. Joanna Wietrzyk in the Ludwik Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, Polish Academy of Sciences in Wrocław. In the tests of antiproliferative activity, it has been proved that almost all synthesized compounds show higher activity than free forms of selected acids and, what is particularly important from the practical point of view, their action is selective towards tumor cells. At the determined cytotoxic doses these conjugates remain non-toxic towards cells with undisturbed proliferation process. Among the tested compounds, 1-veratroyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (VA-LPC) showed the strongest activity, inhibits proliferation of human leukemia (IC50=9.52 μM), breast (IC50=20.7 μM) and colon (IC50=16.7 μM) cancer cells, respectively, at doses more than 38-, 28- and 19-fold lower than those determined for veratric acid. Phosphatidylcholine containing anisic acid at the sn-1 position (ANISA-LPC) was also found to be active against cells of the same cancer lines. At IC50 doses ranging from 21.1 to 48.4 μM, it effectively inhibited cancer cell proliferation by being 7 to 12 times more active than the free form of this acid. In the course of studies conducted against doxorubicin-resistant colon cancer cells (LoVo/DX) it was also demonstrated that all tested conjugates are able to overcome drug resistance of this cancer cell line. On the other hand, based on the analysis of the results obtained during the study of the mechanisms of action of three the most active conjugates against leukemia cells of the MV4-11 line, it was found that 1-anisoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (ANISA-LPC) and 1-palmitoyl-2-cynamoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1-PA-2-CA-PC) act as cytostatic agents, whereas 1-veratroyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (VA-LPC) acts as a cytotoxic agent. Due to the promising results of the in vitro studies, in the second stage of the thesis an attempt was made to develop an enzymatic process for production of phospholipid derivatives of anisic and veratric acid by means of a one-step acidolysis reaction of natural phosphatidylcholine isolated from egg-yolk catalyzed by commercially available lipases selective towards to the sn-1 position of phospholipids. The research at this stage involved the selection and optimization of basic parameters such as type of biocatalyst, reaction environment, substrate molar ratio, enzyme load, temperature and reaction time. In the case of modification of natural phosphatidylcholine with anisic acid as the main product of an acidolysis reaction catalyzed with lipase from Candida antarctica (Novozym 435), anisoyl-2-lysophosphatidylcholine (ANISA-LPC) was obtained in 28.5% isolation efficiency under optimized parameters by running the reactions for 72 h in a binary solvent system being a mixture of toluene and chloroform (9:1, v/v) and using 30% by weight of enzyme, a substrate molar ratio PC:ANISA 1:15 and temperature of 50°C. An attempt of enzymatic incorporation of veratric acid into the phosphatidylcholine structure failed. This fact can be explained by the inhibitory effect of the presence of two methoxy groups in the aromatic ring of the acid molecule, which is a spatial barrier having a significant influence on the course of enzymatic reaction of acidolysis. Taking into account the confirmed in vitro anticancer potential of phospholipid derivatives of selected aromatic acids and proved on the example of phospholipid derivatives of anisic acid possibility of their preparation under milder conditions of enzymatic process, it can be concluded that the obtained results make a valuable contribution to the research initiated by the team on preparation of this type of conjugates, which would find in the future practical application as nutraceuticals with chemopreventive activity or as agents supporting the classical anticancer therapy.

status: finished

collation: 214