PL: Opracowanie lipidowych nanosystemów dostarczania niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) i ich wielofunkcyjnych biokoniugatów do zastosowań w terapii nowotworów | EN: Development of Lipid Nanosystems of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs (NSAIDs) and their Multifunctional Bioconjugates for Targeting Cancer Treatment

abstractPL: Choroby nowotworowe są obecnie jednym z największych wyzwań dla sektora medycznego i farmaceutycznego, a prognozy Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) wskazują niestety na ciągły wzrost skali zachorowań w kolejnych latach. Do 2050 roku liczba zdiagnozowanych pacjentów z rakiem ma wzrosnąć do 35 milionów, a poziom śmiertelności z powodu raka szacuje się, że przekroczy 18,5 miliona. Liczne podtypy nowotworów, ich zmienność genetyczna jak i mnogość czynników determinujących ich powstawanie i rozwój utrudniają znalezienie skutecznych środków przeciwnowotworowych i efektywnych terapii, które ograniczyłyby skalę problemu. Choć choroby nowotworowe są bardzo złożone to jednym z kluczowych czynników odpowiedzialnych za ich powstawanie jest przedłużający się stan zapalny w organizmie. Związek pomiędzy zapaleniem, a rozwijaniem się procesów nowotworowych został po raz pierwszy opisany przez niemieckiego patologa Rudolfa Virchowa w XIX wieku. Stąd niektóre ze współcześnie stosowanych terapii przeciwnowotworowych oparte są na wygaszaniu stanów zapalnych. Niestety opracowanie nowych terapii i leków jest niezwykle czasochłonnym i kosztownym procesem, dlatego coraz częściej poszukuje się rozwiązań opartych na określaniu nowych celów terapeutycznych dla leków dostępnych już na rynku, stosując trend ich „repozycjonowania”. Ogromny potencjał w zakresie hamowania procesów zapalnych wykazują niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ). Badania doświadczalne, epidemiologiczne oraz kliniczne jednoznacznie wskazują również na ich działanie przeciwnowotworowe. Niestety ich przewlekłe przyjmowanie wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zaburzeń ze strony przewodu pokarmowego oraz poważnych powikłań sercowo-naczyniowych, dlatego pomimo obiecujących wyników badań nie znalazły one dotychczas zastosowania w terapii nowotworów. W kontekście powyższych problemów i aktualnie dostępnych danych literaturowych celem rozprawy doktorskiej było opracowanie efektywnych systemów dostarczania dwóch wybranych niesteroidowych leków przeciwzapalnych: deksibuprofenu (DXI) i indometacyny (IND) dla terapii antynowotoworowej. Realizacja celu została oparta na zastosowaniu lipidów (fosfolipidów) oraz lipidowych nanocząstek do opracowania formulacji tych leków i sprawdzeniu ich potencjału przeciwnowotworowego w modelu in vitro. Ta strategia miała z założenia prowadzić do poprawy skuteczności działania przeciwnowotworowego wybranych leków oraz ich selektywności działania. W rezultacie przeprowadzonych eksperymentów opracowano nowe nanostrukturalne nośniki lipidowe (NLC) z enkapsulowanym deksibuprofenem (DXI-NLC) i indometacyną (IND-NLC) spełniające wymagania w zakresie farmaceutycznym co do składu (komponenty o statusie GRAS) jak i parametrów fizykochemicznych (rozmiar nanocząstek <200 nm, wskaźnik polidyspersyjności <0,2, wysoki ujemny potencjał zeta, poziom enkapsulacji >80%). Formulacje charakteryzowały się także stabilnością podczas przechowywania oraz wydłużonym poziomem uwalniania. Aktywność antyproliferacyjna otrzymanych nanoformulacji DXI-NLC i IND-NLC została przebadana względem komórek raka prostaty (linia PC-3) i raka piersi (linia MDA-MB-468). Nanocząstki z enkapsulowanym deksibuprofenem efektywnie hamowały wzrost komórek nowotoworowych linii PC-3 i MDA-MB-486 przy stężeniu odpowiednio 10,1 i 3,4 µM po 24 godzinach inkubacji. Podczas gdy indometacyna w formie nanocząstek wykazała najsilniejsze działanie antyproliferacyjne względem komórek raka piersi linii MDA-MB-486, których wzrost był hamowany po 48 h inkubacji z IND-NLC przy stężeniu 15,7 µM. W kolejnym etapie wykorzystując strategię łączenia leków z cząsteczkami o charakterze lipidowym, zsyntezowano czternaście fosfolipidowych pochodnych deksibuprofenu i indometacyny, z których jedenaście to związki nowe, dotychczas nieopisane w literaturze. Ich struktury chemiczne zostały potwierdzone za pomocą analizy spektroskopowej, a aktywność antyproliferacyjna przebadana w modelu in vitro względem komórek bifenotypowej białaczki mielomonocytowej B (MV4-11), ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuc (A-549), ludzkiego raka prostaty (PC-3) i ludzkiego raka piersi (MCF-7 i MDA-MB-468). Bezpieczeństwo ich stosowania zostało ocenione względem nienowotworowych ludzkich komórek nabłonkowych sutka (MCF-10A). Za kontrolę posłużyły roztwory wolnych form leków DXI i IND. Wśród badanych związków najbardziej aktywne okazały się lizofosfatydylocholiny DXI/IND-LPC, których efekt antyproliferacyjny był od 44 do 100 razy większy w porównaniu do wolnych form leków, a działanie selektywne względem komórek nowotworowych. W grupie heteropodstawionych fosfatydylocholin najwyższą aktywność zaobserwowano dla fosfatydylocholin zawierających jako fragment acylowy w pozycji sn-1 lub sn-2 kwas oleinowy DXI/IND-OA-PC oraz OA-DXI/IND-PC. Dla sześciu najbardziej aktywnych związków przeprowadzono badania zmierzające w kierunku oceny ich działania na poziomie molekularnym i potwierdzono, że DXI/IND-LPC, DXI/IND-OA-PC i OA-DXI/IND-PC mogą znacząco hamować wzrost komórek nowotworowych w różnych fazach cyklu komórkowego i indukować ich śmierć. Potwierdzono, że DXI/IND-LPC indukują apoptozę w badanych liniach komórek nowotworowych i może to być efektem indukcji aktywności kaspazy-3/7. Z drugiej strony, odnotowano, że DXI/IND-OA-PC i OA-DXI/IND-PC częściej powodowały martwicę komórek nowotworowych i nie miały znaczącego związku z indukcją aktywności kaspazy-3/7, z wyjątkiem OA-IND-PC, który indukował zarówno apoptozę, jak i aktywność kaspazy-3/7. Na podstawie badań przesiewowych oraz po uwzględnianiu wyników z modelowania komputerowego jak również aspektów metabolicznych jakim podlegają fosfolipidy w organizmie człowieka do kolejnego etapu badań wybrano dwa koniugaty DXI-OA-PC i IND-OA-PC i poddano je procesowi enkapsulacji w nanostrukturalnych nośnikach lipidowych. Otrzymane nanformulacje DXI-OA-PC-NLC, IND-OA-PC-NLC spełniały kryteria stawiane nanocząstkom do zastosowań farmaceutycznych i charakteryzowały się wydłużonym stopniem uwalniania z matrix lipidowego. Badając aktywność antyproliferacyjną fosoflipidowych konjugatów deksibuprofenu i indometacyny enkapsulowanych w nanostrukturalnych nośnikach lipidowych NLC w zestawieniu z aktywnością wolnych form leków, ich formulacji (DXI/IND-NLC) oraz roztworów koniugatów fosfolipidowych najlepsze efekty biologiczne uzyskano dla NLC z enkapsulowanymi koniugatami. Aktywność antyproliferacyjna DXI-OA-PC-NLC i IND-OA-PC-NLC była od 2,2 do 18,7 razy wyższa niż wolnych koniugatów. Ponadto w badaniach przy użyciu cytometrii przepływowej i znakowania formulacji za pomocą barwnika fluorescencyjnego (czerwień Nilu) udowodniono wychwyt komórkowy nanocząstek oraz szybką penetrację komórek nowotworowych, co potwierdza realizację założonych celów i opracowanie efektywnego systemu dostarczania DXI i IND dla terapii antynowotoworowej.

abstractEN: Cancer is currently one of the greatest challenges for the medical and pharmaceutical sectors, and unfortunately the projections of the World Health Organization (WHO) indicate that the scale of the problem will increase in the following years. By 2050, the number of diagnosed cancer patients is expected to rise to 35 million, with cancer-related mortality exceeding 18.5 million. The numerous cancer subtypes, their genetic variability, and the multitude of factors influencing their development makes it difficult to find effective anticancer agents and efficient therapies that could mitigate the scale of the problem. Although cancer diseases are highly complex, one of the key factors occurring in their development is prolonged. The link between inflammation and the development of cancer processes was first described by the German pathologist Rudolf Virchow in the 19th century. Consequently, some contemporary anticancer therapies are based on reducing inflammation. Unfortunately, the search for new therapies and drugs is an extremely time-consuming and costly process, which is why there is a growing trend towards "drug repurposing" identifying new therapeutic targets for drugs already available on the market. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) have shown great potential in inhibiting inflammatory processes. Experimental, epidemiological, and clinical studies unequivocally indicate also their anticancer effects. However, chronic use of these drugs is associated with an increased risk of gastrointestinal disturbances and serious cardiovascular complications. Therefore, despite promising research results, they have not yet found application in cancer therapy. Considering these issues and the currently available literature, the goal of the doctoral dissertation was to develop effective systems for delivering two selected nonsteroidal anti-inflammatory drugs: dexibuprofen (DXI) and indomethacin (IND) in the context of cancer therapy. The achievement of this goal was based on the use of lipids (phospholipids) and lipid nanoparticles to develop effective formulations encapsulating these drugs and to assess their anticancer potential in an in vitro model. This strategy was intended to improve the anticancer efficacy and selectivity of the selected drugs. As a result of the experiments, new nanostructured lipid carriers (NLC) were developed with encapsulated dexibuprofen (DXI-NLC) and indomethacin (IND-NLC) that met pharmaceutical requirements regarding composition (GRAS status components) and physicochemical parameters (nanoparticle size <200 nm, polydispersity index <0.2, high negative zeta potential, encapsulation efficiency >80%). The formulations also demonstrated stability during storage and prolonged release profiles. The antiproliferative activity of the obtained DXI-NLC and IND-NLC was tested against prostate cancer cells (PC-3 line) and breast cancer cells (MDA-MB-468 line). DXI-NLC effectively inhibited the growth of PC-3 and MDA-MB-486 cancer cells at concentrations of 10.1 and 3.4 µM, respectively, after 24 hours of incubation. Meanwhile, IND-NLC exhibited the strongest antiproliferative effect against MDA-MB-486 breast cancer cells, with growth inhibition observed after 48 hours of incubation at a concentration of 15.7 µM. In the subsequent stage, utilizing a strategy of combining drugs with lipid-like molecules, fourteen phospholipid derivatives of DXI and IND were synthesized, eleven of which are novel compounds not previously described in the literature. Their chemical structures were confirmed through spectroscopic analysis, and their antiproliferative activity was tested in an in vitro model against cells of biphenotypic B myelomonocytic leukemia (MV4-11), human non-small cell lung cancer (A-549), human prostate cancer (PC-3), and human breast cancer (MCF-7 and MDA-MB-468). The safety of their use was assessed against non-cancerous human breast epithelial cells (MCF-10A). Solutions of free forms of DXI and IND drugs were used as controls. Among the studied compounds, the most active were the lysophosphatidylcholines DXI-LPC and IND-LPC, which antiproliferative effect was 44 to 100 times greater compared to the free forms of the drugs, and their action was selective towards cancer cells. In the group of heterosubstituted phosphatidylcholines, the highest activity was observed for phosphatidylcholines containing oleic acid as the acyl fragment in the sn-1 or sn-2 position: DXI/IND-OA-PC and OA-DXI/IND-PC. Studies were conducted to assess their molecular level effects, and it was confirmed that six the most active conjugates DXI/IND-LPC, DXI/IND-OA-PC and OA-DXI/IND-PC could significantly inhibit cells in different phases of the cell cycle and induce cancer cell death. DXI/IND-LPC caused apoptosis in tested cancer cell lines and found that this could be the effect of its high induction of the caspase-3/7 activity. On the other hand, DXI/IND-OA-PC and OA-DXI/IND-PC were more likely to cause necrosis to cancer cells and they had no significant effect on the induction of caspase-3/7 activity except OA-IND-PC which caused apoptosis and activation of caspase-3/7. Based on screening studies and considering the results from computer modeling and the metabolic aspects that phospholipids undergo in the human body, DXI-OA-PC and IND-OA-PC were selected for the next stage of research and were subjected to encapsulation in nanostructured lipid carriers. The obtained nanoformulations DXI-OA-PC-NLC, IND-OA-PC-NLC showed suitable physicochemical properties and exhibited a prolonged release profile from the lipid matrix. When examining the antiproliferative activity of phospholipid conjugates of DXI and IND encapsulated in nanostructured lipid carriers (NLC) compared to the activity of the free forms of the drugs, their formulations, and phospholipid conjugate solutions, the best biological effects were obtained for NLC with encapsulated conjugates. This antiproliferative activities of DXI-OA-PC-NLC and IND-OA-PC-NLC were from 2.2 to 18.7 times higher than the activity of the free conjugates. Furthermore, studies using flow cytometry and fluorescent dye labeling (Nile Red) of the formulations confirmed the cellular uptake of nanoparticles and their rapid penetration into cancer cells, which validates the achievement of the established goals and the development of an effective system for delivering DXI and IND for cancer therapy.

status: finished

collation: 253