Determinantes genéticos para a produção de ácido linoleico conjugado em Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 2230

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2021.

O ácido linoleico conjugado (CLA) é um produto intermediário da via de biohidrogenação do ácido linoleico (LA) em bactérias. Diversas espécies bacterianas capazes de converter eficientemente o LA em CLA foram amplamente relatadas na literatura, dentre elas Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 2330. Pesquisas recentes propuseram a hipótese de um sistema enzimático multi-componente constituído por três enzimas envolvidas no processo de biohidrogenação do LA em Lactobacillus. Neste trabalho, foi descrita a identificação taxonômica da bactéria Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 2330 tanto por técnicas bioquímica como moleculares. O genoma foi sequenciado, obtendo uma versão rascunho com 135 contigs. Os dados genômicos foram utilizados para uma melhor classificação taxonômica da bactéria com base em dados multi-locus, bem como para uma análise do perfil de resistência a antibióticos O genoma foi ainda anotado com relação à genes relacionados a diferentes subsistemas celulares. A busca no genoma por genes relacionados à síntese de CLA, identificou apenas um (putativamente codificando uma oleato hidratase), dentre os descritos na literatura. O gene oleH de L. bulgaricus LBP UFSC 2230 foi identificado, clonado em vetores de expressão e introduzidos nas linhagens receptoras Lactobacillus paracasei NFBC 338, sob controle de promotor constitutivo e Escherichia coli BL21(DE3), sob controle de um promotor induzível. A construção inserida em E. coli foi utilizada para ensaios in vivo de expressão heteróloga, bem como para a purificação da proteína recombinante utilizada em ensaios in vitro para caracterização da atividade enzimática. O efeito biológico da enzima OleH de L. bulgaricus LBP UFSC 2230 na hidratação de LA e desidratação do ácido ricinoleico e seu possível papel na produção de CLA foram investigados. Verificou-se que a enzima é uma hidratase / desidratase, levando à transformação reversível entre LA e ácido ricinoleico demonstrando atividade na presença de FAD. Além disso, os resultados mostraram que a proteína OleH de L. bulgaricus LBP UFSC 2230 desempenha um papel na tolerância ao estresse em E. coli. Em conclusão, a OleH de L. bulgaricus LBP UFSC 2230 catalisa a etapa inicial do metabolismo de saturação do ácido linoleico, embora não tenha convertido os substratos diretamente em CLA.

Abstract: Conjugated linoleic acid (CLA) is an intermediate product of the biohydrogenation pathway of linoleic acid (LA) in bacteria. Several bacterial species capable of efficiently converting linoleic acid to CLA have been widely reported in the literature, among them Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 2230. Recent researches have proposed a hypothesis of a multi-component enzymatic system consisting of three enzymes involving the biohydrogenation process of LA in Lactobacillus. In the present work, the taxonomic identification of the bacterium Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LBP UFSC 2330 by both biochemical and molecular techniques was described. The genome was sequenced, obtaining a draft version with 135 contigs. The genomic data were used for a better taxonomic classification of the bacterium based on multi-locus data, as well as for an analysis of the antibiotic resistance profile. The genome was also noted with respect to genes related to different cellular subsystems. The search in the genome for genes related to CLA synthesis, identified only one (putatively encoding an oleate hydratase), among those described in the literature. The L. bulgaricus LBP UFSC 2230 oleH gene was identified, cloned into expression vectors and introduced into the receptor strains Lactobacillus paracasei NFBC 338, under the control of a constitutive promoter and Escherichia coli BL21 (DE3), under the control of an inducible promoter. The construct inserted in E. coli was used for in vivo assays of heterologous expression, as well as for the purification of the recombinant protein used in in vitro assays to characterize the enzymatic activity. The biological effect of the OleH enzyme of L. bulgaricus LBP UFSC 2230 on the hydration of LA and dehydration of ricinoleic acid and its possible role in the production of CLA were investigated. It was found that the enzyme is a hydratase / dehydratase, leading to a reversible transformation between LA and ricinoleic acid showing activity in the presence of FAD. In addition, the results showed that L. bulgaricus LBP UFSC 2230 OleH protein plays a role in stress tolerance in E. coli. In conclusion, the OleH of L. bulgaricus LBP UFSC 2230 catalyzes the initial stage of saturation metabolism of linoleic acid, although it has not converted the substrates directly into CLA.