Desenvolvimento de ferramentas para detecção de desreguladores endócrinos na avaliação da qualidade da água do Reservatório de Segredo/Rio Iguaçu, PR

Orientador (a): Prof(a). Dr(a). Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro

Coorientador (a): Prof(a). Dr(a). Flávia Yoshie Yamamoto

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação. Defesa : Curitiba, 30/11/2021

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Resumo: O Rio Iguaçu é considerado o segundo rio mais poluído do país e ao mesmo tempo é de fundamental importância socioeconômica e ambiental, tanto pelo fornecimento de recursos hídricos e o seu elevado potencial hidroelétrico, como pela alta taxa de endemismo da sua ictiofauna. Estudos recentes mostraram que o reservatório de Segredo, localizado no Médio Rio Iguaçu, apresentou a existência de fontes difusas de contaminação, que podem estar comprometendo a qualidade da água do reservatório. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade da água do Reservatório de Segredo, através da detecção de desreguladores endócrinos em três localidades ao longo do reservatório. Para isso, foram realizadas padronizações de técnicas moleculares para expressão de VTG, aplicação das técnicas em amostras do grupo tratamento (expostos aos DES) e análises químicas, referentes aos poluentes orgânicos persistentes - POP's (pesticidas organoclorados, PCB's e PBDEs) que podem apresentar potencial efeito desregulador endócrino estrogênico. Além disso, foram realizadas análises de biomarcadores histopatológicos em gônada e a detecção dos níveis plasmáticos de vitelogenina (VTG) em duas espécies de peixes: Rhamdia quelen e Oreochromis niloticus mantidas em tanques redes por 6 meses (períodos de outono/inverno e primavera/verão); e Oreochromis niloticus mantida por 12 meses no reservatório. Assim como, outras espécies nativas coletadas no reservatório foram utilizadas no estudo. Paralelamente, a expressão de vtg foi investigada nas amostras de plasma obtidas com os experimentos de exposição in situ acima através de western blotting utilizando outros anticorpos produzidos para outras espécies de peixes no Laboratório. Os resultados com relação à análise química da água, sedimento e músculos demonstraram que o ponto Iratim (IR) apresentou as maiores concentrações de POPs, com exceção dos DDTs na água, que foi maior no ponto Floresta (FL), ambos para estação inverno. As nos pontos BA e IR (outono/inverno) e Al nos mesmos pontos (primavera/verão), além dos metais tóxicos Fe, Cu e Zn no ponto IR (primavera/verão) foram detectados acima do limite de acordo com legislação Conama 357/2005. Já para os sedimentos, As e Cu foram detectados em todos os pontos e estações acima do limite máximo de detecção, conforme Resolução Conama 454/2012 para material dragado. Esses resultados estão relacionados às atividades agropecuárias da região e vai de encontro com o menor IGS (Índice Gonadossomático) dos animais em exposição no ponto IR, nas duas coletas (inverno e verão). Com relação às análises moleculares, o melhor anticorpo, diluição e concentração da proteína para a expressão de vtg no western blotting com amostras de plasma de tilápia respectivamente é o anti-VTG-R de Oreochromis niloticus (tilápia), na diluição de 1:10000 e concentração 0,5 Mi g mL-1 e o mesmo anticorpo na diluição de 1:7000 e 1,0 Mi g mL-1 para Rhamdia quelen. O Elisa sanduíche se mostrou eficiente para a especificidade e sensibilidade com as amostras de tilápias. É importante destacar que esses resultados denotam possíveis fontes difusas de poluição e ressalta-se que a mistura com outros poluentes, mesmo em baixas concentrações podem acentuar o efeito estrogênico, interferindo negativamente com a qualidade da água e consequentemente colocando em risco a saúde da ictiofauna do Rio Iguaçu.

Abstract: The Iguaçu River is considered the second most polluted river in the country and at the same time it is of fundamental socioeconomic and environmental importance, both for the supply of water resources and its high hydroelectric potential, as well as for the high rate of endemism of its ichthyofauna. Recent studies have shown that the Segredo reservoir, located on the Middle Iguaçu River, presented the existence of diffuse sources of contamination, which may be compromising the water quality of the reservoir. Therefore, the objective of this work was to evaluate the water quality of the Segredo Reservoir, through the detection of endocrine disruptors in three locations along the reservoir. For this, standardization of molecular techniques for expression of VTG, application of the techniques in samples of the treatment group (exposed to DES) and chemical analyzes were carried out, referring to persistent organic pollutants - POP's (organochlorine pesticides, PCB's and PBDEs) that may have potential Estrogenic endocrine disrupting effect. In addition, analyzes of histopathological biomarkers were performed in gonads and the detection of plasma levels of vitellogenin (VTG) in two fish species: Rhamdia quelen and Oreochromis niloticus kept in net tanks for 6 months (autumn/winter and spring/summer periods); and Oreochromis niloticus maintained for 12 months in the reservoir. As well as other native species collected in the reservoir were used in the study. In parallel, the expression of vtg was investigated in the plasma samples obtained from the above in situ exposure experiments by western blotting using other antibodies produced for other fish species in the Laboratory. The results regarding the chemical analysis of water, sediment and muscles showed that the Iratim point (IR) had the highest concentrations of POPs, with the exception of DDTs in the water, which was higher at the Floresta point (FL), both for the winter season. As at points BA and IR (autumn/winter) and Al at the same points (spring/summer), in addition to the toxic metals Fe, Cu and Zn at point IR (spring/summer) were detected above the limit according to Conama legislation 357 /2005. As for sediments, As and Cu were detected at all points and stations above the maximum detection limit, according to Conama Resolution 454/2012 for dredged material. These results are related to agricultural activities in the region and are in line with the lowest GSI (Gonadosomatic Index) of the animals on display at the IR point, in both collections (winter and summer). Regarding molecular analysis, the best antibody, dilution and protein concentration for the expression of vtg in western blotting with tilapia plasma samples, respectively, is the anti-VTG-R of Oreochromis niloticus (tilapia), at a dilution of 1:10000 and concentration 0.5 Mi g mL-1 and the same antibody in the dilution of 1:7000 and 1.0 Mi g mL-1 for Rhamdia quelen. Elisa sandwich proved to be efficient for specificity and sensitivity with tilapia samples. It is important to highlight that these results denote possible diffuse sources of pollution and it is noteworthy that mixing with other pollutants, even at low concentrations, can accentuate the estrogenic effect, negatively interfering with water quality and consequently putting the health of the ichthyofauna of the river at risk. Iguazu River.