Avaliação e otimização de protocolos de armazenamento e inibição de amostras de DNA ambiental para detecção e quantificação de Limnoperna fortunei

Orientador: Prof. Dr. Antonio Ostrensky

Coorientador: Dr. Giorgi Dal Pont

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia. Defesa : Curitiba, 13/05/2024

Inclui referências

Resumo: Esta tese teve como objetivo avaliar e otimizar protocolos de acondicionamento e inibição de amostras contendo DNA ambiental (eDNA), além de comparar os métodos analíticos convencionais e moleculares em ambientes límnicos, visando superar as dificuldades detectadas na aplicação de técnicas moleculares baseadas em eDNA. Para otimizar os protocolos analíticos, realizou-se uma revisão sistemática da literatura (Capítulo I), identificando 15 substâncias inibitórias de PCR comumente encontradas em amostras de água contendo eDNA, como ácidos húmicos e polissacarídeos, e estratégias para minimizar sua ação, como o uso de aditivos e métodos de purificação. Em seguida, avaliou-se a taxa de degradação do eDNA em condições análogas às observadas durante o acondicionamento de amostras após a coleta (Capítulo II). Experimentos controlados, variando temperatura e tempo de armazenamento, revelaram que a degradação ocorre já nas primeiras horas após a coleta, com taxas mais acentuadas em temperaturas elevadas, enfatizando a importância da rápida estabilização ou processamento das amostras. Os resultados dos Capítulos I e II foram cruciais para estabelecer as estratégias aplicadas no último capítulo, como a escolha de métodos de preservação de amostras e o uso de aditivos para mitigar a inibição da PCR. Por fim, um estudo comparativo entre os métodos analíticos convencional e molecular foi realizado no monitoramento de Limnoperna fortunei em 16 bacias do estado do Paraná (Capítulo III), demonstrando a maior sensibilidade e especificidade do método molecular e a importância de considerar as limitações de cada abordagem. Esta tese contribui para o avanço das técnicas moleculares baseadas em eDNA, fornecendo diretrizes para otimizar protocolos de acondicionamento e inibição de amostras, além de evidenciar as vantagens e desafios da aplicação desses métodos no monitoramento de espécies aquáticas invasoras, como L. fortunei, com implicações relevantes para o aprimoramento de estratégias de conservação e manejo em ambientes límnicos

Abstract: This thesis aimed to evaluate and optimise protocols for the storage and inhibition of samples containing environmental DNA (eDNA) and to compare conventional and molecular analytical methods in lentic environments to overcome the difficulties encountered in applying eDNA-based molecular techniques. A systematic literature review was conducted (Chapter I) to optimise the analytical protocols, identifying 15 PCR-inhibiting substances commonly found in water samples containing eDNA, such as humic acids and polysaccharides, and strategies to minimise their action, including the use of additives and purification methods. Subsequently, the degradation rate of eDNA was assessed under conditions analogous to those observed during sample storage after collection (Chapter II). Controlled experiments, varying temperature and storage time, revealed that degradation occurs within the first hours after collection, with higher rates at elevated temperatures, emphasising the importance of rapid stabilisation or processing of samples. The results from Chapters I and II were crucial for establishing the strategies applied in the final chapter, such as the choice of sample preservation methods and the use of additives to mitigate PCR inhibition. Lastly, a comparative study between conventional and molecular analytical methods was conducted for monitoring Limnoperna fortunei in 16 watersheds in the state of Paraná (Chapter III), demonstrating the higher sensitivity and specificity of the molecular method and the importance of considering the limitations of each approach. This thesis contributes to the advancement of eDNA-based molecular techniques, providing guidelines for optimising sample storage and inhibition protocols, as well as highlighting the advantages and challenges of applying these methods in the monitoring of invasive aquatic species, such as L. fortunei, with relevant implications for the improvement of conservation and management strategies in lentic environments