Winter Hardiness and Freezing Tolerance of Winter Faba Bean (Vicia faba L.): From QTL Identification and Validation to Genome-Wide Predictions of Genotypic Values

Das wachsende Interesse an pflanzenbasierten Proteinen und einem nachhaltigeren Agrarsystem mit erweiterten Fruchtfolgen, reduziertem Düngemitteleinsatz sowie einer höheren Vielfalt an Kulturpflanzen und Fauna hat angesichts des Klimawandels zugenommen. Die Ackerbohne (Vicia faba L.), eine lokal angepasste, kühle-tolerante Leguminose, stellt die beste Alternative zu nicht nachhaltigen Sojaimporten dar. Ihr Anbaugebiet wächst kontinuierlich in europäischen Ländern. Obwohl die im Herbst ausgesäte Winterackerbohne gegenüber der Sommerackerbohne einen deutlichen Ertragsvorteil von bis zu 47% bietet, wird sie derzeit nur in Frankreich und Großbritannien im großen Maßstab angebaut. Der limitierende Faktor ist die unzureichende Winterhärte, wodurch kalte Winter mit Temperaturen unter -12 °C eine ernsthafte Gefahr darstellen und zu schwerwiegenden Ertragsverlusten durch Auswinterung führen können. Bisher war der Zuchtfortschritt zur Verbesserung der Winterhärte begrenzt. Die Selektion im Feld erfordert gut differenzierende Winterbedingungen, die jedoch selten auftreten. Daher wurden künstliche Screening-Methoden zur Erfassung der Frosttoleranz entwickelt, um die Identifizierung von QTLs und eine bessere Selektion zu ermöglichen. Die Frosttoleranz ist die Hauptkomponente der Winterhärte. Obwohl im Genpool der echten Winterackerbohnen eine große genetische Variation für Frosttoleranz und Winterhärte existiert, wurden Forschungs- und Zuchtfortschritte durch das Fehlen geeigneter genomischer Werkzeuge und Methoden erschwert. Daher könnte die QTL-Identifizierung und Entwicklung von SNP-Markern für die Markergestützte Selektion (MAS) den Zuchtfortschritt in der Winterackerbohnenzüchtung erheblich steigern. Das kürzlich veröffentlichte V. faba Referenzgenom sowie kostengünstige Hochdurchsatz-Genotypisierungsplattformen könnten den Zuchtfortschritt weiter beschleunigen, indem sie eine genomweite Vorhersage von genotypischen Werten ermöglichen. Angetrieben vom Klimawandel werden mildere Winter mit plötzlichen, aber schweren Frost- und Spätfrostereignissen immer wahrscheinlicher. Daher sollte die Toleranz gegenüber Spätfrost ebenso wichtig bewertet werden wie die Toleranz gegen Frost im Winter. Das Ziel dieser Dissertation war es daher, die quantitativen genetischen Ursachen der Winterfrost- und Spätfrosttoleranz in europäischen Winterackerbohnen mittels modernster genomischer Methoden zu entschlüsseln. In Kapitel 2 wurde die genetische Variation für Spätfrosttoleranz bei Winterackerbohnen untersucht. Hierfür musste die Screening-Methode, die zur Untersuchung der Winterfrosttoleranz entwickelt wurde, angepasst werden, um eine ausreichende Enthärtung und somit eine genaue Erfassung der Spätfroststressreaktion zu ermöglichen. Die untersuchten 188 Winterackerbohnenlinien zeigten in den sieben Experimenten unter Spätfrostbehandlung eine signifikante genetische Variation für Spätfrosttoleranz. Diese Variation bietet die Möglichkeit auf eine verbesserte Spätfrosttoleranz zu züchten. Die hohe, jedoch nicht perfekte Korrelation zwischen den drei untersuchten frostrelevanten Submerkmalen sowie die mittels GWAS identifizierten QTLs verdeutlichen die stark quantitativen Eigenschaften der Spätfrosttoleranz. Trotzdem konnten einige QTLs mit großen Effekten identifiziert werden, was darauf hindeutet, dass MAS für diese Merkmale in Züchtungsmaterial erfolgreich angewendet werden könnte. Insbesondere die Identifikation von mindestens zwei pleiotropen QTLs, die mehrere frostrelevante Submerkmale beeinflussen, erscheint vielversprechend. Darüber hinaus erwies sich die Vorhersage der genotypischen Werte basierend auf geschätzten Marker-Effekten als effektiver Ansatz für eine Multi-Marker-basierte MAS, wobei Vorhersagegenauigkeiten (`prediction ability´) von bis zu 0,57 erreicht wurden. In Kapitel 3 wurde die genetische Architektur der Frosttoleranz weiter untersucht, indem insgesamt 13 frostrelevante Submerkmale sowie zusätzliche morphologische Merkmale für Winter- und Spätfrosttoleranz analysiert wurden. Zur detaillierten Untersuchung dieser Merkmale wurde auf bereits veröffentlichte phänotypische Daten zurückgegriffen, um einen umfassenden Vergleich der beiden Toleranzeigenschaften in denselben 188 Inzuchtlinien zu ermöglichen. Die Identifikation von identischen QTLs in beiden Frostbehandlungen, deutet drauf hin, dass sowohl Winter- als auch Spätfrosttoleranz teilweise von denselben Genen beeinflusst werden. Allerdings wurde der überwiegende Teil der phänotypischen Variation von behandlungsspezifischen QTLs erklärt, was darauf schließen lässt, dass die Winterfrosttoleranz in gehärteten Pflanzen und Spätfrosttoleranz in enthärteten Pflanzen größtenteils von unterschiedlichen Genen beeinflusst wird. Zudem wurde festgestellt, dass sowohl Frostschäden, wie Turgor- und Farbverlust der Blätter, als auch das Überleben nach starkem Frost durch spezifische sowie pleiotrope QTLs beeinflusst werden. Die Validität der GWAS-Ergebnisse wurde mittels eines zweistufigen Validierungsansatzes in einer unabhängigen Stichprobe von 64 Winterackerbohnenlinien überprüft, die ebenfalls auf ihre Winter- und Spätfrosttoleranz hin phänotypisiert wurden. Mehrere QTLs konnten in dieser Validierung bestätigt werden, was sie als vielversprechende Ziele für eine Kandidatengensuche ausweist. Tatsächlich wurden innerhalb der wichtigsten pleiotropen QTLs vielversprechende Kandidatengene mit Bezug zur Vernalisation gefunden, die auch frühere Erkenntnisse aus anderen Leguminosen bestätigen. Gleichzeitig zeigte die Validierung jedoch auch die Grenzen der GWAS auf und unterstrich die Notwendigkeit einer Validierung in unabhängigen genetischen Hintergründen, wie beispielsweise in Zuchtmaterial. Da ein Großteil der phänotypischen Varianz trotz der Identifikation von großen QTLs weiterhin unerklärt geblieben ist, befasst sich Kapitel 4 mit der Evaluierung des Potenzials genomischer Vorhersagen. Mittels genomischer Vorhersage kann die Notwendigkeit von Signifikanztests der Marker-Merkmal Assoziationen und die QTL-Identifikation umgangen werden. Neben den frostrelevanten Submerkmalen wurden auch mehrere agronomisch bedeutende Merkmale, einschließlich Ertrag, auf der Basis eines 16-jährigen historischen Feldversuchsdatensatzes untersucht. Dies ist besonders relevant, da Genomische Selektion bisher kaum in der Ackerbohnenzüchtung erforscht wurde. Die Anwendung eines einfachen GBLUP-Modells ergab bereits bei relativ kleinen Trainingspopulationen Vorhersagegenauigkeiten von über 0,35 für nahezu alle frostrelevanten Submerkmale und agronomischen Merkmale. Diese Ergebnisse unterstreichen das hohe Potenzial der Genomischen Selektion für die (Winter-)Ackerbohnenzüchtung. Die Anzahl der SNPs im Vorhersagemodell hatte bis zu einer Untergrenze von 5000 SNPs nur einen geringen Einfluss auf die Vorhersagegenauigkeit. Allerdings zeigte sich deutlich, dass eine abnehmende genetischen Verwandtschaft zwischen der Trainingspopulation und den vorherzusagenden Genotypen die Vorhersagegenauigkeit erheblich beeinträchtigen kann. Diese Ergebnisse liefern somit wertvolle Anhaltspunkte für die praktische Umsetzung in der Züchtung. Darüber hinaus erwies sich die Vorhersage von Genotypen in unbekannten Umwelten, also Umwelten, die nicht im Trainingsdatensatz enthalten waren, als besonders schwierig. Die spezifischen Genotyp-Umwelt-Interaktionen sowie die Heritabilität der Merkmale hatten einen starken Einfluss auf die Vorhersagegenauigkeit in diesen Szenarien. Abschließend zeigte eine vorläufige Evaluierung eines indirekten Genomischen Selektionsansatzes, dass frostrelevante Submerkmale als Proxy für die Winterhärte im Feld genutzt werden können, um den Zuchtfortschritt für diese in der Winterackerbohnenzüchtung zu beschleunigen. Zusammenfassend leistet diese Dissertation einen bedeutenden Beitrag zum Verständnis der genetischen Architektur der Frosttoleranz bei Winterackerbohnen. Hierbei erwies sich die Erfassung der Frosttoleranz unter künstlichen, kontrollierten Bedingungen als erfolgreich. Allerdings bringt diese Methode sowohl für die Forschung als auch für die Züchtung spezifische Vor- und Nachteile mit sich, die in Kapitel 5 diskutiert werden. Darüber hinaus ermöglichte die Nutzung genomweiter Marker eine QTL-Identifikation für Frosttoleranz mit einer bisher unerreichten Auflösung in der Ackerbohne. Es konnte eine Vielzahl validierter Marker identifiziert werden, die sowohl für die Kandidatengensuche als auch für MAS genutzt werden können. Allerdings hat die Anwendung von GWAS-basierten Markern in der MAS auch seine Grenzen, die berücksichtigt werden müssen. Die Kombination aus GWAS und Genomischer Selektion eröffnet neue Möglichkeiten zur Optimierung der Selektion in der (Winter-)Ackerbohnenzüchtung. In Kapitel 5 werden daher Konzepte und Ideen zur Verbesserung der genomischen Vorhersage durch Integration validierter Marker in Vorhersagemodelle sowie zur effizienten Implementierung der Genomischen Selektion in ein Ackerbohnenzuchtprogramm zur Beschleunigung des Zuchtfortschritts erläutert.

The growing interest in plant-based proteins and a more sustainable agricultural system, with wider crop rotations, reduced fertilizer input, and increased crop and fauna diversity, has intensified in response to climate change. Faba bean (Vicia faba L.), as locally adapted cool-season grain legume, is a viable alternative to unsustainable soybean imports, and its cultivation area is continuously increasing in Europe countries. Although autumn sown winter faba bean offers a significant yield advantage of up to 47% over spring faba bean, large scale cultivation is currently limited to France and the UK. The primary constraint is insufficient winter hardiness, as cold winters with frost below -12 °C pose a serious risk, often resulting in winterkill and substantial yield losses. To date, breeding progress for improved winter hardiness has been limited. Field-based selection depends on well-differentiating winters, which are rare. Consequently, artificial screening methods for assessing freezing tolerance have been developed to facilitate QTL identification and support selection decisions. Freezing tolerance is the major component of winter hardiness. Despite the broad genetic variation for freezing tolerance and winter hardiness present in the genuine winter faba bean gene pool, research and breeding efforts have been hindered by a lack of genomic tools and methods. Accordingly, QTL identification and SNP marker development for marker-assisted selection (MAS) could markedly enhance genetic gain for these traits in winter faba bean breeding. The recently published V. faba reference genome, along with the availability of low-cost, high-density genotyping platforms, could further accelerate genetic gain by enabling genome-wide predictions of genotypic values. As climate change progresses, milder winters with less predictable but severe frosts and late-frost events are likely to become more frequent. Therefore, tolerance to late-frost should be considered equally important as tolerance to frost in winter. The objective of this dissertation was to decipherer the quantitative genetic architecture of winter-frost and late-frost tolerance in European winter faba bean using state-of-the-art genomic approaches and methods. In Chapter 2, the genetic variation for late-frost tolerance in winter faba bean was investigated. For this purpose, the screening method, which was developed for the investigation of winter-frost tolerance, had to be adapted to enable sufficient dehardening and thus an accurate assessment of the late-frost stress response. A set of 188 winter faba bean inbred lines was studied in a series of seven late-frost treatment experiments, revealing significant genetic variation for late-frost tolerance. This genetic variance provides opportunities for breeding to enhance the level of late-frost tolerance in winter faba bean. The high but incomplete correlation among the three freezing-related sub-traits, combined with the trait-specific marker-trait associations identified via GWAS, confirmed the highly quantitative nature of late-frost tolerance. However, large-effect QTLs were identified, suggesting the potential for substantial genetic gain through MAS when applied in breeding populations for selection or allele introgression. In this regard, identification of at least two pleiotropic QTLs affecting multiple freezing-related sub-traits offers promising MAS targets. Moreover, prediction of genotypic values based on GWAS-estimated marker effects proved effective for multi-marker-based MAS, achieving prediction abilities of up to 0.57. To further dissect the genetic architecture of freezing tolerance, the comprehensive set of 13 freezing-related sub-traits and additional morphological traits were investigated for both late-frost tolerance and winter-frost tolerance in Chapter 3. Previously published detailed phenotypic data on winter-frost tolerance were used to facilitate an in-depth comparison of these traits in the same set of 188 inbred lines. Several large-effect QTLs were identified as treatment-unspecific, indicating their involvement in both winter-frost and late-frost tolerance. However, most of the phenotypic variance for winter-frost and late-frost tolerance was explained by treatment-specific QTLs. Apparently, tolerance to winter-frost, i.e., in hardened plants, is controlled by both distinct and overlapping genetic mechanisms as the tolerance to late-frost, i.e., in dehardened plants. Furthermore, both frost stress symptoms, such as loss of turgor and color in leaves, and the survival under severe frost seem to be affected by a combination of trait-specific and major pleiotropic QTLs. In addition, the reliability of GWAS results was evaluated through a two-step validation approach in an independent set of 64 winter faba bean lines, which were also phenotyped for winter-frost and late-frost tolerance. Several marker-trait associations were verified in this independent dataset, highlighting associated QTLs as high-confidence targets for candidate gene identification. Indeed, credible candidate genes for freezing tolerance involved in vernalization were identified within the major pleiotropic QTLs, corroborating previous findings in other legumes. However, the two-step validation approach also exposed limitations of the GWAS study design and emphasized the need for validating GWAS results in independent genetic background such as a breeding population. Despite the identification of numerous large-effect QTLs based on high-quality phenotypic data, a substantial proportion of the observed phenotypic variance for both winter-frost and late-frost tolerance remained unexplained. To circumvent the need for significance testing of marker-traits associations and QTL identification, the potential of genomic prediction for marker-based selection for freezing tolerance was evaluated in Chapter 4. This evaluation also includes several agronomically important traits, such as yield, derived from a comprehensive 16-year historical field trial dataset, as genomic prediction has not yet been extensively studied in faba bean. A simple genomic best linear unbiased prediction (GBLUP) model achieved reasonable prediction abilities (>0.35) for almost all freezing-related sub-traits and agronomic traits, even with relatively small training population sizes. These results suggest a high potential for implementing genomic selection in (winter) faba bean breeding. The number of SNPs used in the prediction model had only limited effect on the prediction ability if not reduced below 5,000 SNPs. However, a clear decline in prediction ability was observed when genetic relatedness between the training population and the predicted genotypes decreased. Both findings provide important information for consideration of practical implementation. Additionally, predicting a genotype’s performance in "new" environments (i.e., environments not included in the training dataset) remains a major challenge, as genotype-by-environment interactions and limited heritability values significantly affect prediction ability in such "across-cycle" prediction scenarios. Finally, genomic prediction of freezing-related sub-traits could also be integrated into an indirect genomic selection strategy, using these sub-traits as proxies for winter hardiness in the field. Preliminary evaluations of this indirect genomic selection approach predicted a promising acceleration of genetic gain for winter hardiness. In conclusion, this dissertation represents a significant contribution to the understanding of the genetic architecture of freezing tolerance in winter faba bean. Artificial screening for freezing tolerance played a key role in this research. Nevertheless, its advantages and limitations for both research and breeding were critically discussed in Chapter 5. In addition, utilization of genome-wide markers enabled QTL identification for freezing tolerance at a resolution which has not been possible in faba bean before. A large set of verified high-confidence markers was identified, offering valuable resources for candidate gene search and MAS. However, application of GWAS-derived markers in MAS has certain limitations that should be considered. With both GWAS and genomic prediction now available, the optimal integration of these approaches into (winter) faba bean breeding programs must be evaluated to drive genetic gain. Chapter 5 provides an outlook on how the performance of genomic prediction could be improved by integrating the verified marker into the prediction model. Additionally, several concepts and ideas for effectively incorporating genomic prediction into a line breeding program are proposed to enable accelerating genetic gain in (winter) faba bean breeding.

2025-06-18