Producción recombinante y caracterización estructural y funcional del metabolón N-acetilglutamato sintasa/N-acetilglutamato quinasa de levadura | Recombinant production and structural and functional characterization of the metabolon N-acetylglutamate synthase/N-acetylglutamate kinase of yeast | Producció recombinant i caracterització estructural i funcional del metaboló N-acetilglutamat sintasa/N-acetilglutamat quinasa de llevat

[ES] La N-acetilglutamato sintasa (NAGS) humana es una enzima altamente inestable, cuyo déficit provoca hiperamonemia congénita o de aparición tardía, dependiendo de la mutación. Esta enzima es responsable de la producción de N-acetil-L-glutamato (NAG), el activador esencial de la carbamoilfosfato sintetasa I (CPS1), que cataliza el primer paso del ciclo de la urea y actúa como un verdadero interruptor de esta ruta metabólica. La regulación de NAGS por arginina es fundamental para su correcto funcionamiento, y se ha observado que la pérdida de esta regulación también está asociada con la enfermedad. La NAGS humana pertenece a un tipo de enzima estructuralmente no caracterizado, al igual que la NAGS de levadura. A diferencia de las NAGS bacterianas, que están bien caracterizadas, estas enzimas son intrínsecamente inestables; sin embargo, en levadura, la NAGS se estabiliza al formar un complejo con la N-acetil-L-glutamato quinasa (NAGK), dando lugar a un metabolón. El objetivo de este trabajo es producir recombinantemente el metabolón NAGK-NAGS de levadura para su caracterización estructural y funcional. Para ello, se llevará a cabo la producción recombinante del complejo en E. coli y su purificación mediante cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión molecular (SEC). En el ámbito estructural, se utilizará la proteína purificada para continuar los estudios mediante criomicroscopía electrónica (cryoEM), iniciados con anterioridad en el laboratorio, que han permitido resolver la estructura de este complejo NAGK-NAGS de levadura tanto en ausencia de ligandos como en presencia de arginina. En este proyecto, se prepararán muestras en presencia de sustratos con el fin de obtener su estructura en esta condición, lo que ayudaría a entender el mecanismo de regulación por arginina. Aunque los estudios de cryoEM serán llevados a cabo por otros miembros del grupo y en colaboración con el servicio de cryoEM del IBV-CSIC, un objetivo del TFG será familiarizarse con la técnica, comprender su funcionamiento y seguir de cerca el proceso y los resultados obtenidos. En el ámbito funcional, se realizarán ensayos de actividad enzimática para ambos componentes del metabolón (NAGK y NAGS) en ausencia y presencia de arginina, y se analizará el efecto de la arginina en la masa molecular y homogeneidad del complejo utilizando técnicas de cromatografía de exclusión molecular (SEC) y SEC-MALS (cromatografía de exclusión molecular acoplada a dispersión de luz multiángulo). Un aspecto clave de este estudio será verificar si la proporcionalidad entre los componentes NAGK y NAGS del metabolón es una característica constante o si, por el contrario, es posible detectar poblaciones heterogéneas que presenten distintas proporciones entre ambos componentes. Para ello, se analizará la proporción relativa de NAGK y NAGS mediante análisis densitométrico de geles SDS-PAGE y se compararán estas proporciones con las actividades enzimáticas observadas en diferentes fracciones del cromatograma, con el fin de determinar si dicha proporción es constante y si es consistente con la proporción observada en la estructura.

[EN] Human N-acetylglutamate synthase (NAGS) is a highly unstable enzyme, the deficiency of which causes congenital or late-onset hyperammonemia, depending on the mutation. This enzyme is responsible for the production of N-acetyl-L-glutamate (NAG), the essential activator of carbamoylphosphate synthetase I (CPS1), which catalyzes the first step of the urea cycle and acts as a true switch of this metabolic pathway. The regulation of NAGS by arginine is essential for its proper functioning, and it has been observed that the loss of this regulation is also associated with the disease. Human NAGS belongs to a structurally uncharacterized type of enzyme, just like yeast NAGS. Unlike bacterial NAGS, which are well characterized, these enzymes are inherently unstable; however, in yeast, NAGS is stabilized by forming a complex with N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK), giving rise to a metabolon. The objective of this work is to recombinantly produce the yeast NAGK-NAGS metabolon for its structural and functional characterization. To this end, the recombinant production of the complex in E. coli and its purification will be carried out by affinity chromatography and molecular exclusion chromatography (SEC). In the structural field, the purified protein will be used to continue the studies by cryo-electron microscopy (cryoEM), previously initiated in the laboratory, which have allowed the structure of this NAGK-NAGS yeast complex to be resolved both in the absence of ligands and in the presence of arginine. In this project, samples will be prepared in the presence of substrates in order to obtain their structure in this condition, which would help to understand the mechanism of regulation by arginine. Although the cryoEM studies will be carried out by other members of the group and in collaboration with the cryoEM service of the IBV-CSIC, one objective of the TFG will be to become familiar with the technique, understand how it works and closely follow the process and the results obtained. In the functional field, enzyme activity assays will be performed for both components of the metabolon (NAGK and NAGS) in the absence and presence of arginine, and the effect of arginine on the molecular mass and homogeneity of the complex will be analyzed using molecular exclusion chromatography (SEC) and SEC-MALS (molecular exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering) techniques. A key aspect of this study will be to verify whether the proportionality between the NAGK and NAGS components of the metabolon is a constant characteristic or if, on the contrary, it is possible to detect heterogeneous populations that present different proportions between both components. To this end, the relative proportion of NAGK and NAGS will be analyzed by densitometric analysis of SDS-PAGE gels and these proportions will be compared with the enzymatic activities observed in different fractions of the chromatogram, in order to determine if this proportion is constant and if it is consistent with the proportion observed in the structure.

Beltrán Pérez, N. (2025). Producción recombinante y caracterización estructural y funcional del metabolón N-acetilglutamato sintasa/N-acetilglutamato quinasa de levadura. Universitat Politècnica de València. https://riunet.upv.es/handle/10251/221353

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