CHV1 hypovirus infection on Cryphonectria parasitica - effects on pathogenesis and laccase activity

Mestrado de dupla diplomação com a Université Libre de Tunis

Biological control by hypovirulence is an efficient method to control chestnut blight. The presence of Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) in Cryphonectria parasitica reduces its parasitic growth and sporulation capacity, female fertility, pigmentation, oxalate accumulation and laccase production. Indeed, laccases are involved in lignin degradation, and are also considered as a virulence determinant in C. parasitica. The aim of this work was to evaluate the laccase production in both virulent and converted strains and to access the virulence of these strains in vitro and on dormant chestnut stems. Five isolates were converted with two characterized hypovirulent C. parasitica isolates (RBB111, SR44.2). To evaluate the virulence of the isolates, dormant chestnut stems were inoculated with the virulent isolates, their converted ones and the hypovirulent isolates. The qualitative evaluation of laccase production was performed using Bavendamm test and RBBR test. For quantitative evaluation of laccase production strains were grown on PDB (Potato Dextrose Broth, 24g/L) and the sample readings taken by spectrophotometry using ABTS. The hypovirulent isolates used in this work has complete ability to convert virulent isolates. The infection area on chestnut stems caused by virulent strains was significantly higher (P<0.05) than the infection area caused by converted strains. In the Bavendamm test, the virulent isolates Cast13, Cast26 and VDP11 showed the highest dark area indicator of a higher enzymatic activity while the converted isolates by SR44.2 or RBB111, showed a great reduction of the coloration and this is more observed in the converted isolates by RBB111. For the quantitative assay the specific activity was determined and showed that among all the virulent isolates VDP11 had the highest laccase activity followed by Cast13 and this activity was reduced also in the converted ones especially with RBB111.

O controlo biológico por hipovirulência é um método eficiente para controlar o cancro do castanheiro. Em Cryphonectria parasitica a presença de Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) reduz o seu crescimento, capacidade de esporulação, fertilidade feminina, pigmentação, acumulação de oxalato e produção de lacase. As lacases estão envolvidos na degradação da lignina, e também são consideradas como fatores da virulência em C. parasitica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de lacase, tanto em estirpes virulentas como convertidas e avaliar a virulência destas estirpes in vitro e em ramos dormentes e destacados de castanheiro. Cinco isolados virulentos de C. parasitica foram convertidos com dois isolados hipovirulentos anteriormente caracterizados (RBB111, SR44.2). Para avaliar a virulência dos isolados, os ramos dormentes de castanheiro foram inoculados com os isolados virulentos, os convertidos e os isolados hipovirulentos. A avaliação qualitativa da produção de lacase foi efetuada através do teste Bavendamm e do teste RBBR. Para avaliação quantitativa de lacase as estirpes em estudo foram cultivadas em PDB (Potato Dextrose Broth, 24g/L) e as leituras das amostras obtidas por espectrofotometria utilizando ABTS. Os isolados hipovirulentos utilizados neste trabalho evidenciaram total capacidade de converter os isolados virulentos. A área de infeção nos caules de castanheiro causada por estirpes virulentas foi significativamente maior (P<0,05) do que a área de infeção causada por estirpes convertidas. No teste de Bavendamm, os isolados virulentos Cast13, Cast26 e VDP11 mostraram o maior indicador de área escura, indicadora de maior actividade enzimática, enquanto que os isolados convertidos por SR44.2 ou RBB111 evidenciaram redução da intensidade de coloração, mais evidente nos isolados convertidos por RBB111. Para o ensaio quantitativo, a actividade enzimática específica foi determinada, evidenciando a maior actividade no isolado virulento VDP11, logo seguido pelo Cast13. Nos isolados convertidos a actividade específica lacásica decresceu, especialmente nos convertidos com RBB111.