Identificación Molecular de Esporas de Hongos Micorrízicos Arbusculares Relacionadas Fenotípicamente con Especies del Género Glomus spp en Suelos de Cultivos de Yuca y Frijol | Molecular identification of spores of Arbuscular Mycorrhizal Fungi phenotypically related to species of the genus Glomus spp in soils of Yucca and Bean crops

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La investigación se centró en la identificación molecular de esporas de Hongos Micorrizícos Arbusculares (HMA) relacionadas a las especies del género Glomus spp en suelos de cultivo de Yuca y Frijol en Mariangola, Cesar, se recolectaron 1000g de suelo, de los cuales se aislaron esporas mediante una técnica modificada a partir de la propuesta de Gendermann & Nicholson (1963) se utilizaron cuatro tamices con tamaño de poros que oscilaron entre 500µm a 38 µm, las esporas fueron seleccionadas y desinfectadas con cloramina T al 2% y una solución antibiótica (200 mg de estreptomicina sulfatada y 100 mg de gentamicina sulfatada) las esporas se inocularon en raíces de vitroplanta de yuca estéril micropropagadas en medio MS, se estableció el sistema de cultivo autotrófico con medio MRS – M en cámara húmeda (HR 70%) e incubó a 28°C, HR del 30%, fotoperiodo de 16 horas luz y monitoreo a intervalos de quince días por observación al estereomicroscopio. Se obtuvieron ocho micorrizas viables de las cuales se extrajo ADN que fue amplificado utilizando cebadores ITS 5 y 4 y luego se sometió a digestión enzimática con Taq I, Hinf I, Mbo I, los perfiles obtenidos se analizaron usando UPGMA para determinar la similaridad, evidenciando que tres micorrizas (M2, M4 y M6) se relacionó con Glomus mosseae, mientras que dos (las M1 y M3), mostraron similitudes a los géneros Glomus, Paraglomus, Acaulospora y una (M8) no mostró similitud con los perfiles reportados, la caracterización morfológica realizada preciso el género de estas esporas, la molecular sugiere que al ser nativas presenten variaciones genéticas o resulten ser nuevas especies que no están descritas aún, lo cual representa un aporte a nivel teórico sobre la diversidad de los HMA autóctonos del Caribe seco en Colombia, avanzando en el conocimiento de estos microorganismos para agricultura sostenible.

The research focused on the molecular identification of spores of Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) related to the species of the genus Glomus spp in soils of cassava and bean cultivation in Mariangola, Cesar, 1000 g of soil were collected, from which spores were isolated using a modified technique from the proposal of Gendermann & Nicholson (1963) four sieves were used with pore sizes ranging from 500 µm to 38 µm, the spores were selected and disinfected with 2% chloramine T and an antibiotic solution (200 mg of sulfated streptomycin and 100 mg of sulfated gentamicin) the spores were inoculated into micropropagated sterile cassava vitroplant roots (CIAT) in MS medium, the autotrophic culture system was established with MRS - M medium in a humid chamber (RH 70%) and incubated at 28°C, 30% RH, 16-hour light photoperiod and monitoring at fifteen-day intervals by observation under a stereomicroscope. Eight viable mycorrhizae were obtained from which DNA was extracted and amplified using ITS primers 5 and 4 and then subjected to enzymatic digestion with Taq I, Hinf I, Mbo I, the profiles obtained were analyzed using UPGMA to determine the similarity, showing that three mycorrhizae (M2, M4 and M6) were related to Glomus mosseae, while two (M1 and M3), showed similarities to the genera Glomus, Paraglomus, Acaulospora and one (M8) showed no similarity with the reported profiles, the morphological characterization carried out specified the genus of these spores, the molecular characterization suggests that being native they present genetic variations or turn out to be new species that are not yet described, which represents a contribution at a theoretical level on the diversity of the autochthonous AMF of the Colombia dry Caribbean, advancing in the knowledge of these microorganisms for sustainable agriculture.

Maestría

Magíster en Biotecnología

Universidad de Santander

Introducción 20 Problema de Investigación 24 Justificación 29 Objetivos 32 Objetivo General 32 Objetivos Específicos 32 Marco de Referencia 33 Marco Teórico 39 Yuca 40 Micropropagación de Yuca (Manihot esculenta) 41 Hongos 42 Hongos Formadores de Micorrizas 43 El Género Glomus 44 Identificación de Hongos Formadores de Micorrizas 44 Cultivo In vitro de Hongos Micorrizícos Arbusculares (HMA) 45 Cultivo Autotrófico de HMA 46 Técnicas de Biología Molecular para Identificar HMA 47 Metodología 49 Primera Etapa: Toma y Procesamiento de la Muestra de Suelo 49 Limpieza de las Esporas Aisladas 51 Desinfección de las Esporas Aisladas 51 Pasos del Procedimiento de Desinfección de Esporas HMA Modificado 52 Segunda Etapa: Establecimiento del Cultivo In Vitro de las Esporas 53 Cultivo In vitro de Yuca 53 Establecimiento de Vitroplantas de Yuca en Sistema de Cultivo Autotrófico 54 Inoculación de Esporas en Cultivo Autotrófico de Yuca 55 Tercera Etapa: Análisis Molecular de las Esporas Bioaumentadas 57 Extracción de Ácido Nucleico 57 Cuantificación del ADN 58 Amplificación del ADN Genómico de las Esporas Utilizando PCR 59 Electroforesis 61 Digestión Enzimática 62 Los resultados de la Electroforesis se Interpretó de la Siguiente Forma 63 Resultados y Discusión. 64 Aislamiento de Esporas de HMA del suelo 64 Verificación de la Desinfección Realizada a las Esporas Seleccionadas 67 Viabilidad de Esporas Mediante Prueba de Germinación 68 Micropropagación de Yuca en Sistema de Cultivo Autotrófico 71 Cultivo Autotrófico de Yuca 71 Inoculación de Esporas Al Cultivo Autotrófico de Yuca 73 Micorrizas Obtenidas 74 Digestión enzimática con las enzimas de restricción TaqI, HinfI, MboI, de las Muestras. 76 Conclusiones 84 Recomendaciones 85 Referencias Bibliográficas 86 Apéndice 101