Investigating the potential of raffinose family oligosaccharides for applications towards food by means of biorefining, fermentation and enzymatic tailoring

Interest in pulses has increased in recent years. The focus is predominantly on the proteins and their functionality in food products while the carbohydrate fraction has received less attention. Part of this fraction are raffinose family oligosaccharides (RFOs), which are present up to 6 % of the dry weight in pulses. Humans are however unable to digest RFOs and they therefore pass through the small intestine to the lower digestive tract, where they are readily fermented by bacteria. This classifies them as fermentable oligo-, di-, and monosaccharides and polyols (FODMAP) as they cause symptoms such as bloating, nausea or diarrhoea in many consumers. For people with gastrointestinal conditions, such as irritable bowel syndrome (IBS), it is therefore often recommended to omit these carbohydrates from their diet. In healthy consumers on the other hand, RFOs can also stimulate growth of beneficial bacteria, i.e. they can have prebiotic effects. This thesis argues that RFOs can be exploited for value-added use through modern biorefining, fermentation and enzyme technologies. Therefore, in Paper 1 an industrially feasible biorefining process was developed to isolate RFOs from pulse protein concentrates available on the Scandinavian market. It could be shown that by using scalable process equipment, water and moderately acidic pH, the production of 1 kg carbohydrate-enriched extract per 10 kg of concentrate from faba beans or peas can be achieved. RFO content in the extract varied between faba beans and peas (30-50 % RFO), yet protein fractions were RFO-reduced by 70-90 % and increased in protein content (+5-6 %). This process therefore creates a more valuable protein extract (more protein, fewer FODMAPs) and a carbohydrate stream that can serve as a resource for further food production or beyond. To test this, Paper 2 investigated fermentations, specifically the potential to selectively stimulate growth of desired microorganisms in food products and the influence on sensory properties. A total of 14 lactic acid bacteria were screened for growth with RFO extract from Paper I in media and in beer with stressors presents (alcohol, α-acids). From this screening, three bacteria (Lactobacillus sp., Lactococcus sp.) were selected to brew sour beers in co-culture with yeast (Brettanomyces sp.) and RFOs. Via chromatography, it was shown that the selected bacteria consumed RFOs, and both acids and other metabolites increased in concentration within only three weeks. A trained sensory panel compared the sour beers made with RFO extract with a traditional Belgian sour beer and negative controls (no RFOs) and found that many sensory attributes were affected by RFO addition. Several parameters of RFO beers were comparable to the commercial product, for which the production process typically takes years. Beany taste, which is commonly associated with peas, did however not increase through RFO addition and was even lower than in the Belgian beer (made without pulses). In Paper 3 enzymatic modifications were investigated as a second biotechnological approach to utilize RFOs. Lactose and sucrose are commonly used in the enzymatic production of prebiotic oligosaccharides. For raffinose, this potential is however underexplored. Therefore, we combined RFOs with lactose and the established transglycosylating enzyme BgaD-D from Niallia circulans. This generated new-to-nature oligosaccharides, that were hypothesized to be fermentable by fewer microorganisms, which could reduce FODMAP-associated gastrointestinal symptoms in consumers. Reactions showed RFOs as suitable acceptors and reaction characteristics were comparable to lactose alone. Through nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy analysis, structures were identified, majorly being galactosyl-(β1-4)-RFOs. These reaction products were then subjected to a fermentability screening with 12 bacteria relevant to food and gut. Results indicated reduced fermentability by some of the selected strains, whilst the commensal gut bacteria Bacteroides sp. seemingly grew unaffected. This showed the potential of RFOs as substrate for enzymatic synthesis and indicated that this has the potential to mitigate some of the undesired effects of RFOs in the human diet. Overall, this research demonstrated that notable amounts of RFOs can be extracted from readily available feedstocks and that they can serve as a starting point for utilization towards food products and ingredients. This reduces side streams from food production, could expand the groups of consumers otherwise refraining from pulses and moreover creates new possibilities for companies already producing pulse derived ingredients.

Interessen for belgvekster har økt i de siste årene og forskning og utvikling har fokusert mye på proteiner og deres funksjon i mat produkter. Karbohydratene i belgvekster har samtidig fått mindre oppmerksomhet. En av karbohydrattypene i belgvekster er raffinose oligosakkarider (RFOs), som utgjør opp mot 6 % av frøet. Mennesker er ikke i stand til å bryte ned disse oligosakkaridene selv og derfor havner de i tykktarmen hvor mikroorganismer nyttiggjør seg av dem. Dette er grunnlaget for at RFOs kategoriseres som FODMAPs (fermenterbare oligo-, di- og monosakkarider og sukkeralkoholer) og at de ved inntak kan forårsake negative symptomer hos mennesker som oppblåsthet, kvalme og diaré. Mennesker med fordøyelsessykdom som IBS (irritabel tarm syndrom) er ofte anbefalt å unngå disse i kostholdet sitt. For sunne mennesker kan slike oligosakkarider derimot stimulere til vekst av gunstige tarmbakterier som gir positive helseeffekter, og disse karbohydratforbindelsene kan da klassifiseres som prebiotika. Hypotesen i denne avhandlingen er at det er mulig å utnytte RFOs bedre enn det gjøres i dag og at dette kan gjøres ved å bruke moderne bioraffinerings-, fermenterings- og enzymteknologier. I det første arbeidet (manuskript 1) ble det utviklet en industrianvendelig bioraffinerings prosess for å isolere RFOs fra protein konsentrater fra nordiske belgvekster. Studien viste, at ved å bruke skalerbart utstyr og vann med noe redusert pH, kan man produsere 1 kg med RFO-ekstrakt per 10 kg proteinkonsentrat. RFO innholdet i ekstraktet varierte mellom åkerbønner og erter (30-50% RFOs), men den opprinnelige protein fraksjonen fikk likevel redusert RFO inneholdet med 70-90 % og fikk samtidig et noe høyere protein innehold (+5-6 %) enn ved startpunktet. Prosessen skaper dermed en mer verdifull proteinfraksjon (mer protein, mindre FODMAPs), samtidig som karbohydratene som fjernes kan brukes videre til å lage andre mat produkter, prebiotika og ingredienser. For å teste mulige anvendelser ble det i manuskriptet 2 undersøkt om hvordan RFO ekstraktene kan stimulere vekst av ønskede melkesyrebakterier i fermenterte mat produkter og samtidig hvordan sensoriske egenskaper blir påvirket. 14 bakteriestammer ble testet for vekst på RFOs isolert fra arbeidet med manuskript 1 i både generelle vekstkultur media og øl hvor veksthemmende substanser (etanol, humle) er til stede. Etter screeningen ble tre stammer (to Lactobacillus og en Lactococcus) valgt for å produsere to typer surøl med RFOs og gjær (Brettanomyces) i co-kulturer. Kromatografisk analyse av produktene viste at bakteriene omsatte RFOs og at konsentrasjon av syrer og andre metabolitter økte innen tre uker. I tillegg sammenlignet et trent smakspanel de RFObaserte surølene med et tradisjonelt belgisk surøl, samt kontroll-øl uten RFOs. Panelet fant at RFO tilsetning økte flere smakskarakteristikker og at noen av dem er sammenlignbare med belgisk øl som trenger flere år å produseres. Spennende nok, økte RFO tilsetning ikke smak av bønner, ofte et problem med ingredienser fra belgvekst, og det belgisk ølet smakte ifølge den sensoriske testen mest av bønner. I manuskript 3 ble en annen bioteknologisk bruk av RFOs undersøkt: Enzymatisk modifisering. Bruk av laktose og sukrose er vanlig for å produsere prebiotiske oligosakkarider gjennom enzymatisk transglykosylering. Her er potensiale til RFOs mindre utforska. Derfor brukte studien RFOs sammen med laktose og det velkjente enzymet BgaD-D fra Niallia circulans til å produsere nye typer oligsakkarider med flere ulike typer glykosidbindinger. Hypotesen er at disse er mindre fermenterbare av tarm bakteriene og dermed vil redusere de typiske symptomer av FODMAPs. Reaksjoner viste at RFOs fungerer som akseptor i transglykolyseringen og at viktige reaksjonsparameter ligner på de reaksjonene med laktose alene. Med NMR (kjernemagnetisk resonansspektroskopi) kunne produktene identifiseres og det ble vist at produktene hovedsakelig er av typen galactosyl-(β1-4)-RFO. Disse produktene ble deretter fermentert med 12 bakteriestammer som er relevante for mat og fordøyelse. Resultatene indikerer redusert fermenterbarhet av noen stammer, mens vekst av noen typiske tarmbakterier som er tilpasset vekst på komplekse glykaner (Bacteroides sp.) er tilnærmet upåvirket. Denne studien viste dermed potensiale for enzymatisk modifisering av RFOs til å redusere FODMAP symptomer. Oppsummert viser avhandlingen at betydelige mengder RFOs kan ekstraheres fra kommersielle råstoffer og at de kan fungere som utgangspunkt for å lage mat og ingredienser. Dette reduserer sidestrømmer fra matproduksjonen, kan bidra til forbedring av belgvekstprodukter til de av konsumentene som reagerer på RFOs og også utvide produksjonsmulighetene for industrien som produserer ingredienser som er basert på belgvekster.