Expressão e purificação de uma proteína de Leptospira spp. selecionada in silico e sua aplicação no diagnóstico | Expression and purification of a Leptospira spp. protein selected in silico and its application in diagnosis

Leptospirosis is a zoonotic and cosmopolitan disease caused by bacteria of the Leptospira genus. There are two classification systems for this bacterium: one based on serogroups and serovars, which rely on antigenic determinants Leptospira interrogans (pathogenic), comprising more than 250 serovars and 23 serogroups, and Leptospira biflexa (saprophytic). The second is the genetic classification, in which Leptospira species are divided into 21 genomospecies with more than 300 serovars distributed across 28 serogroups, categorized as pathogenic, intermediate, and non-pathogenic or saprophytic. Leptospira interrogans belongs to the pathogenic group. Knowledge of the most effective measures to prevent leptospirosis in mammals must be constantly revised, as the disease remains prevalent in various regions worldwide. Therefore, studies utilizing recombinant proteins to enhance new diagnostic and preventive methods against the disease are necessary. The objective of the present study was to express and purify a recombinant protein from Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain M20, which was selected in silico, and to use it as an antigen in an indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies against Leptospira spp. in serum samples from dogs with leptospirosis. The expression of the selected recombinant protein was carried out using Escherichia coli BL21, followed by purification of the expressed product using the AKTA Purifier 100 FPLC system with a Nickel HisTrap HP column (5 × 5 mL). Serum samples from dogs with and without leptospirosis were subjected to the microscopic agglutination test (MAT). The indirect ELISA test was standardized using the recombinant protein as an antigen to differentiate between reactive and non-reactive animals for Leptospira spp. In the MAT, dogs predominantly reacted to the Icterohaemorrhagiae serogroup, with serovar Copenhageni being the most prevalent, as 53.8% (7/13) of the seroreactive animals tested positive. The ELISA results, using the selected recombinant protein as an antigen, showed a statistically significant difference in optical densities (OD) between the groups [t (24) = 2.53; p = 0.018], indicating that the mean OD of seroreactive positive dogs was significantly higher than that of negative dogs. This ELISA demonstrated a sensitivity of 84.62% and a specificity of 61.54%. The expression and purification of the recombinant protein were achieved using a plasmid containing the in silico-selected chimeric protein from Leptospira interrogans Copenhageni strain M20. The indirect ELISA test developed in this study, which utilized the purified recombinant protein as an antigen, was able to detect IgG antibodies against Leptospira spp. in serum samples from dogs with leptospirosis.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Dissertação (Mestrado)

A leptospirose é uma doença de caráter zoonótico e cosmopolita, causada por uma bactéria do gênero Leptospira. Existem dois tipos de classificação dessa bactéria, aquela baseada em sorogrupos e sorovares, através de determinantes antigênicos: Leptospira interrogans (patogênicas) apresentando mais de 250 sorovares e 23 sorogrupos, e a Leptospira biflexa (saprófitas). E a classificação genética, onde as espécies de Leptospira são divididas em 21 genomoespécies com mais de 300 sorovares divididas em 28 sorogrupos, classificadas como: patogênica, intermediárias e não-patogênicas ou saprófitas; e a Leptospira interrogans está inclusa no grupo das patogênicas. O conhecimento sobre medidas mais eficazes para evitar a leptospirose em mamíferos, precisa ser constantemente revista, pois a doença é frequente em várias partes do mundo. Por isso, estudos que utilizam proteínas recombinantes, para o aprimoramento de novos métodos de diagnóstico e prevenção contra a doença são necessários. O objetivo do presente estudo foi realizar a expressão e purificação de uma proteína recombinante da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa M20 que foi selecionada in silico; e utilizá-la como antígeno no teste de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) indireto para a detecção de anticorpos IgG contra Leptospira spp. em amostras de soro de cães com leptospirose. Foram realizadas a expressão da proteína recombinante selecionada por meio da Escherichia coli BL21 e depois o produto da expressão foi purificado por meio do Sistema AKTA Purifier 100 FPLC com a coluna de Níquel HisTrap HP, 5 x 5 ml. Os soros dos cães com e sem leptospirose foram submetidos ao teste de aglutinação microscópica (MAT). O teste de ELISA indireto foi padronizado utilizando a proteína recombinante como antígeno para diferenciação dos animais reagentes e não reagentes para Leptospira spp. No MAT, cães reagiram predominantemente para o sorogrupo Icterohaemorrhagiae, que tem como sorovar o Copenhageni com 53,8% de animais (7/13) sororreativos. Os resultados do ELISA, que utilizou a proteína recombinante selecionada como antígeno, mostraram diferença estatística significativa nas densidades ópticas (OD) entre os grupos [t (24): 2,53; p: 0,018], indicando que a média de OD nos cães reagentes positivos foi significativamente maior, que cães negativos. Este ELISA apresentou sensibilidade de 84,62% e especificidade de 61,54%. A expressão e purificação da proteína recombinante foi possível através do uso plasmídeo que continha a proteína quimérica selecionada in silico da Leptospira interrogans Copenhageni cepa M20. O teste de ELISA indireto desenvolvido neste estudo, que utilizou a proteína recombinante purificada como antígeno, foi capaz de detectar anticorpos IgG contra Leptospira spp. em amostras de soro de cães com leptospirose.

2027-02-10