Separação de espermatozoides de alta qualidade por um método nanotecnológico de ativação magnética em animais selvagens e domésticos | High quality sperm selection by nanotechnology method based on magnetic activation in wild and domestic animals

l of any species. Male fertility requires a lot of attention because sperm has to be able to fertilize oocyte and ensure the embryo’s development. The ejaculates’ quality is highly variable in both domestic and wild species, since it is composed of several spermatic subpopulations, bringing a variety of structural and functional modifications, and some of those abnormalities translate cellular apoptosis and are directly correlated with fertility failures in vivo and in vitro. This study aimed at improving selection of high-quality sperm through sperm separation by magnetic activation in fresh semen of cattle, deer, horses, and domestic cats by evaluating the cells’ quality after the sperm selection process. For this, semen was collected from animals with a high number of spermatic abnormalities (> 30%), being: 1) Nellore bulls (n=21), using the artificial vagina restraint; 2) six Mazama deer, using the electroejaculation technique and after chemical containment; 3) ten horses Mangalarga and American Quarter horse, using the artificial vagina technique, and 4) ten domestic cats without defined breed, using pharmacological ejaculation technique (dexmedetomidine) and urethral catheterization. Semen was analyzed in five statuses: 1) fresh semen; 2) post separation by density gradient centrifugation (DGC); 3) post separation by Magnetic-activated cell sorting (MACS) or Magnetic-activated sperm sorting (MASS) (non-apoptotic part); 4) post separation by MACS or MASS (apoptotic part) and 5) post separation by MACS followed by DGC. Motility was measured using either Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) or optical microscopy, concentration by Neubauer chamber, sperm morphology by phase contrast, and supravital test was completed with eosin/nigrosin staining. In the sperm separation by DGC, 20 x 106 cells were used in a gradient of two layers of 400 μl each of Percoll at 90% and 45%; after centrifugation at 900 G for 5 minutes the pellet was diluted in HEPES. Sperm separation by MACS or MASS used 10 x 106 cells diluted in 1.5 ml of HEPES, followed by centrifugation at 300 G for 10 min. The pellet was resuspended in 150 μl HEPES and 20 μl of nanoparticles bound to anexin V were added; after incubation for 15 minutes at room temperature, filtration was carried out in the MiniMacs™ or MASS. The non-apoptotic fraction was collected in a 2 mL tube and the apoptotic fraction connected to the microspheres was collected by removing the magnet column and adding 300 μl of HEPES. The spermatic separation by MACS followed by DGC was a combination of the two methodologies. The evaluation of cell membrane quality and mitochondrial potential after selection was made using fluorescent probes with FITC/IP and JC-1, respectively, in flow cytometry. In cattle, the combination of the two sperm processing methods (DGC and MACS) was significantly more effective in the production of high-quality sperm samples than using them separately (70% more reduction in abnormalities). The subpopulation of non-apoptotic spermatozoa had morphologically superior sperm quality compared to the apoptotic fraction, as well as higher number of cells with intact membrane and better mitochondrial potential. In cervids, horses, and domestic cats, we found that DGC and MASS techniques were efficient in reducing sperm abnormalities, mainly removing tail and head defects, and the subpopulation of non-apoptotic sperm had morphologically superior sperm quality compared to the apoptotic fraction; the same was observed for the number of cells with intact membrane. In those three species, the motility of the post MASS samples was extremely low, perhaps due to the greater sensitivity of the spermatic cell in the species, the number of procedures to which the cell was submitted, and the large time spent in the analyses. Those findings suggest that that nanotechnological method is efficient in the production of high-quality semen samples for assisted reproduction procedures in both12 domestic and wild animals, but further studies are still needed to better understand the particular characteristics of the spermatic cells of each species, in order to improve the results of the technique.

Pesquisa sem auxílio de agências de fomento

A reprodução é um processo fascinante que ocorre nos mamíferos e é essencial para a sobrevivência de qualquer espécie. A fertilidade do macho requer muita atenção pois os espermatozoides têm que ser capazes de fertilizar o oócito e garantir o desenvolvimento do embrião. A qualidade dos ejaculados é muito variável tanto nas espécies domésticas quanto nas selvagens, pois este é composto por várias subpopulações espermáticas que trazem uma variedade de modificações estruturais e funcionais, sendo que algumas destas anormalidades traduzem apoptose celular e estão correlacionadas diretamente com as falhas de fertilidade in vivo e in vitro. O objetivo do estudo foi realizar a seleção de espermatozoides de alta qualidade através da separação espermática por ativação magnética (MACS/SEAM) em sêmen fresco de bovinos, cervídeos, equinos e felinos domésticos, avaliando a qualidade das células após o processo de seleção espermática. Foi coletado sêmen de animais que apresentaram alta quantidade de anormalidades espermáticas (> 30%), sendo: 1) vinte e um touros adultos da raça Nelore pela técnica de vagina artificial; 2) seis cervídeos do gênero Mazama pela técnica de eletroejaculação, após contenção química; 3) dez equinos das raças Mangalarga e Quarto de Milha pela técnica de vagina artificial e 4) dez gatos domésticos sem raça definida pela técnica de coleta farmacológica (dexmedetomidina) e cateterização uretral. As amostras analisadas foram: 1) sêmen fresco; 2) pós separação por centrifugação em gradiente de densidade (DGC); 3) pós separação por MACS ou SEAM (porção não apoptótica); 4) pós separação por MACS ou SEAM (porção apoptótica) e 5) pós separação por MACS ou SEAM seguida da DGC. Foram realizadas as análises de motilidade (método CASA ou microscopia óptica), concentração (câmara de Neubauer), morfologia do sêmen (contraste de fase) e teste de integridade de membrana celular com coloração eosina/ nigrosina (supravital). Na separação espermática por DGC utilizou-se 20 milhões de espermatozoides em gradiente de duas camadas de 400 μl cada de Percoll a 90% e 45%, que após centrifugação a 900 G por 5 minutos, o pellet foi diluído em HEPES. A separação dos espermatozoides por MACS ou SEAM utilizou 10 milhões de espermatozoides diluídos em 1,5 ml de HEPES, seguido de centrifugação a 300 G por 10 min. O pellet foi ressuspendido em 150 μl de HEPES e adicionado 20 μl de nanopartículas ligadas à anexina V, que após incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, procedeu-se a filtração na coluna de separação magnética MiniMACS™ ou SEAM. A fração não apoptótica foi coletada em tubo de 2 mL e a fração apoptótica ligada às microesferas foi coletada removendo a coluna do imã e adicionando 300 μl do HEPES. A separação espermática por MACS seguida por DGC foi uma conjunção das duas metodologias. A avaliação da qualidade da membrana celular e potencial mitocondrial pós seleção foram feitas utilizando sondas fluorescentes FITC/IP e JC- 1, respectivamente, em citometria de fluxo. Em bovinos a combinação dos dois métodos de processamento de espermatozoides (DGC e MACS) foi significativamente mais efetiva na produção de amostras de espermatozoides de alta qualidade que os mesmos separadamente (redução de mais de 70% nas anormalidades). A subpopulação de espermatozoides não apoptóticos teve qualidade espermática morfologicamente superior em comparação com a fração apoptótica, assim como no número de células com integridade de membrana e no potencial mitocondrial. Em cervídeos, equinos e gatos domésticos, verificamos que as técnicas de DGC e SEAM foram eficientes na redução de anormalidades espermáticas, retirando principalmente defeitos de cauda e cabeça, sendo que a subpopulação de espermatozoides não apoptóticos teve qualidade espermática morfologicamente superior em comparação com a fração apoptótica, o mesmo observado para o número de células com membranas íntegras.10 Nestas três espécies, a motilidade das amostras pós SEAM foi extremamente baixa talvez devido a maior sensibilidade da célula espermática nestas espécies, ao número de procedimentos a que a célula foi submetida e o tempo grande dispendido nas análises. Estes achados sugerem que este método nanotecnológico é eficiente na produção de amostras de sêmen de alta qualidade para procedimentos de reprodução assistida tanto em animais domésticos quanto selvagem, mas ainda são necessários mais estudos para melhor entendimento das características particulares das células espermáticas de cada espécie, a fim de melhorar os resultados da técnica.