The use of frozen semen has become increasingly popular in canine artificial insemination, stimulating research to improve freezing methods and extenders. In this study, was compared the final concentration of 5% ethylene glycol used in 3 equilibration protocols. In Method I, one part of semen was added to two parts of tris-fructose-citric acid with 7.5% ethylene glycol (Extender 2) and frozen without cooling. In Method II, one part of semen was added to two parts of tris-fructose-citric acid with 7.5% ethylene glycol (Extender 2) and cooled at 5ºC for 1 hour before freezing. In Method III, one part of semen was added to one part of tris-fructose-citric without ethylene glycol (Extender 1) and cooled at 5ºC for 1 hour. Just after this period, one part of 5ºC cooled tris-fructose-citric acid containing 15% ethylene glycol (Extender 3) was added to the previous extended semen, maintained at 5ºC for one additional hour and frozen. For freezing in each procedure semen was packaged in 0.5 ml plastic straws and placed for 20 minutes in vapor 5 cm above liquid nitrogen and then lowered into the liquid nitrogen and stored. All samples were thawed by immersion for 30 sec in a 37ºC water bath and immediately evaluated. Progressive motility was best after Method III (63%), which was not different from fresh semen (94%) but was better (p< 0.05) than after Method II (25%) or Method I (6%). Forward velocity was again best after Method III (2.9) comparable to fresh semen (4.6) and Method II (2.5), but better (p< 0.05) than Method I (1.7). Morphological abnormalities were lowest after Method III, but were not significantly different from Methods II or I. Most common abnormalities were detached heads and bent, hairpin and coiled tails. It was concluded that slow, step-wise equilibration in tris-fructose-citrate extender followed by extender with ethylene glycol before freezing seems to produce the best progressive motility and forward velocity in frozen-thawed canine spermatozoa. | A utilização de sêmen congelado tornou-se extremamente comum na prática da inseminação artificial em cães, estimulando a pesquisa de métodos de congelação e diluidores. Neste estudo foram avaliadas as propriedades criopreservativas do etileno glicol na concentração final de 5%, utilizado em 3 diferentes protocolos de congelação. No Método I, uma parte de sêmen foi adicionada a duas partes de tris-frutose-ácido cítrico, contendo 7,5% de etileno glicol e congelado sem prévia refrigeração. No Método II, uma parte de sêmen foi adicionada a duas partes de tris-frutose-ácido cítrico contendo 7,5% de etileno glicol e resfrigerado até 5ºC por 1 hora antes da congelação. No Método III, uma parte de sêmen foi adicionada a uma parte de tris-frutose-ácido cítrico sem etileno glicol e refrigerado até 5ºC por 1 hora, sendo em seguida adicionada uma parte de tris-frutose-ácido cítrico, previamente refrigerado até 5ºC, contendo 15% de etileno glicol, mantido a 5ºC por mais 1 hora e congelado. Para a congelação em cada método, o sêmen foi envasado em palhetas plásticas de 0,5 ml, colocadas em vapor de nitrogênio a 5 cm da coluna líquida por 20 minutos, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas. Todas as amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC durante 30 segundos e imediatamente avaliadas. O Método III não apresentou decréscimo significante da motilidade retilínea progressiva após a descongelação e apresentou os melhores resultados para o vigor espermático, comparando-se aos demais métodos. Entretanto, os 3 métodos não apresentaram diferença significativa com relação aos defeitos espermáticos pós-descongelação. Os tipos de defeitos mais freqüentemente encontrados foram cabeça solta normal, cauda dobrada, fortemente dobrada e fortemente enrolada. Foi possível concluir que o tempo de equilíbrio maior no diluidor tris-frutose-ácido cítrico seguido pela diluição em etileno glicol antes da congelação parece produzir para os espermatozóides de cães a melhor motilidade retilínea progressiva e vigor após a descongelação.

Aiming to evaluate frozen goat semen in TRIS diluent with low egg yolk addition, progressive motility was evaluated soon after freezing and again 4 years later, resulting in 38.2 ± 7.4% and 31.4 ± 13.5%, respectively. Sixteen goats were oestrus synchronized through progesterone impregnated intravaginal sponges followed by PMSG injection on day 9. Vaginal sponges were withdrawn on day 11, with goats being artificially inseminated 46 hours later with semen frozen in straws and stocked during 4 years in liquid nitrogen. The nonreturn rate attained 31.2%. TRIS diluent with low egg yolk addition was considered as efficient in relation to frozen sperm evaluated both in vitro through progressive motility as in vivo through artificial insemination. | Com o objetivo de avaliar o sêmen de caprinos congelado em diluidor à base de TRIS contendo baixa quantidade de gema de ovo, foi feita a análise da motilidade retilínea e progressiva logo após o congelamento e após 4 anos de estocagem em nitrogênio líquido, resultando respectivamente em 38,2 ± 7,47% e 31,43 ± 13,55%. Foi feita a sincronização do cio de 16 cabras com esponjas intravaginais impregnadas com progesterona e aplicações de PMSG no nono dia. No 11º dia as esponjas foram retiradas e após 46 horas foi feita a inseminação artificial com palhetas estocadas por 4 anos. Houve 31,2% de não-retorno ao cio. O diluidor à base de TRIS contendo baixa quantidade de gema de ovo se mostrou eficiente quanto à preservação dos espermatozóides quando avaliados in vitro através da motilidade retilínea e progressiva e in vivo através da inseminação artificial.

Semen was collected from six stud dogs to compare five extenders in the semen freezing process. Each ejaculate was divided in five parts and added to tris-fructose-citric acid, glicine, lactose, skim milk and tris-fructose-citrate extenders. The semen was diluted at 37°C in extenders without glycerol, in the ratio 1:1 and cooled for 60 minutes to reach a 5°C temperature. Then, extenders with glycerol in the ratio of 2:1 were added to give the final prefreezing concentration of 4% of glycerol. The diluted semen with the cryoprotectant was maintained for a further 60 minutes in refrigeration to equilibrate the spermatozoa in the glycerol and packaged in 0.5 ml plastic straws. The straws were maintained for 30 minutes in vapor, plunged and stored in liquid nitrogen. Sperm morphology was evaluated before and after freezing, whereas progressive motility (%) and velocity of forward progression (0-5) were appraised in different periods of the freezing process. The extender tris-fructose-citric acid showed the best post thaw progressive motility and velocity of forward progression compared to the others extenders. Semen freezing increased major sperm morphological abnormalities, regardless of the extender. | Foram utilizados ejaculados de 6 cães para comparar cinco diluidores no processo de congelação de sêmen. Cada ejaculado foi dividido em 5 partes e adicionadas aos diluidores tris-fructose-ácido cítrico, glicina, lactose, leite desnatado e tris-fructose-ácido cítrico. O sêmen foi diluído a 37°C sem adição de glicerol na proporção 1:1 (fração A) e refrigerado durante 60 minutos até atingir a temperatura de 5ºC, quando foi adicionada a fração dos diluidores contendo glicerol (fração B) na proporção 2:1, atingindo a concentração final de 4% de glicerol. O sêmen diluído permaneceu por 60 minutos em refrigeração para equilíbrio no glicerol, sendo envasado em palhetas de 0,5 ml, mantido por 30 minutos no vapor de nitrogênio e imerso e armazenado em nitrogênio líquido. Foram avaliados a motilidade progressiva retilínea, o vigor e os defeitos espermáticos antes da congelação e após a descongelação do sêmen em água a 37°C. Os resultados mostraram que os diluidores tris-fructose-ácido cítrico e glicina apresentaram as melhores médias de motilidade progressiva retilínea e de vigor espermático após a descongelação. A congelação aumentou a freqüência dos defeitos espermáticos maiores independente do diluidor.

Twenty-four ejaculates were collected from five boars for the conventional freezing procedure at the Veterinary School of Hannover (group 1A-1B) and for an extended holding time procedure (group 2A-2B and 3A-3B). The semen were prediluted in two different diluents, coconut water in natura and Merck I medium before freezing (experiment A) and prediluted only with Merck I, but cooling and freezing with coconut water in natura or lactose (experiment B). The semen were arranged into three groups according to the different holding periods before freezing, group 1A-1B (sperm-rich phase, preserved for 4 hours by 15°C), group 2A-2B (sperm-rich phase, preserved for 16 hours by 18°C) and group 3A-3B (total semen, preserved for 16 hours by 18ºC). The quality of the thawed boar spermatozoa was evaluated by subjective motility (SMOT), computerassisted motility (Cell Motion Analyser, Strömberg-Mica - CMOT) and morphology of acrosomal ridges (NAR) after fixation in formol citrate. The acrosomal integrity (NAR) was 65% (group 1A), 71% (group 2A) and 75% (group 3A) for semen prediluted with coconut water and 60% (group 1A), 68% (group 2A) and 68% (group 3A) for semen prediluted with Merck I medium, respectively (experiment A); and 56% (group 1B), 68% (group 2B) and 73% (group 3B) for semen freezing with coconut water diluent, and 60% group 1B), 68% (group 2B and 3B) for semen freezing with lactose (experiment B). Thus, did not differ significantly (p<0.05) between both pre-diluents and both freezing diluents. However, the post thaw motility by both SMOT and CMOT and the acrosome integrity (NAR) were significantly higher (p<0.05) in the semen preserved for extended holding time (group 2A-2B and 3A-3B) than those for short time (group 1A-1B). It is concluded that the extended holding time has a better effect to protect acrosome of boar spermatozoa and also maintain sperm motility. Therefore, preserving boar semen for longer period before freezing is indicated for subsequent research on in vitro research with boar semen. And because the results using coconut prediluent and diluent were similar to that using Merck I medium (experiment A) and using lactose (experiment B), it is also indicated to use coconut for diluent and for freezing boar semen. | Foram utilizados vinte e quatro ejaculados de cinco diferentes cachaços na congelação de sêmen suíno, sendo doze deles pré-diluídos em água de coco in natura e em Merck I, utilizando a lactose como diluidor de refrigeração e de congelação (experimento A) e doze pré-diluídos apenas com Merck I. Após três diferentes pré-tratamentos, a água de coco in natura foi utilizada como diluidor de refrigeração e de congelação, sendo a lactose utilizada como controle (experimento B). Seguiu-se a metodologia convencional de congelação de sêmen desta espécie -Tierärztliche Hochschule Hannover (grupo 1A-1B) e um novo processo com longo período de equilíbrio (grupos 2A-2B e 3A-3B). A qualidade do sêmen descongelado foi avaliada pela motilidade subjetiva (SMOT), motilidade computadorizada (CMOT) e morfologia das células com borda apical normal (NAR), após fixação em formol citrato. As porcentagens de espermatozóides com NAR foram 65% (grupo 1A), 71% (grupo 2A) e 75% (grupo 3A) para o sêmen pré-diluído em água de coco e 60% (grupo 1A), 68% (grupo 2A) e 68% (grupo 3A) para aquele pré-diluído com Merck I (experimento A); e 56% (grupo 1B), 68% (grupo 2B) e 73% (grupo 3B) para o sêmen congelado em água de coco e 60% (grupo 1B), 68% (grupo 2B e 3B) para o sêmen congelado em lactose (experimento B). Não havendo, portanto, diferença estatística entre os dois pré-diluentes e os dois diluentes de refrigeração e de congelação (p&lt;0,05). Concluiu-se, portanto, que 1) os pré-tratamentos com longo período de equilíbrio têm melhor efeito na proteção do acrossoma do espermatozóide suíno e para manter a motilidade espermática e 2) a água de coco como pré-diluente e diluente para refrigeração e de congelação é semelhante ao Merck I (experimento A) e a lactose (experimento B), sendo portanto indicado para pré-diluir e congelar sêmen suíno.

This study was undertaken to determine whether bovine seminal plasma contained protein markers associated with semen freezability. Seminal plasma was obtained from ten Gir bulls of known fertility and freezability, set into two groups of High (up to 80% of viable sperm after thawing) and Low freezability (less than 50%). SDS-PAGE of seminal plasma samples indicated that one protein (Mr =-20.3;-MW-=-61,800Da) predominated in high-freezability semen. These findings indicate that bull seminal plasma contains freezability-associated proteins which can be used as markers for predicting semen freezability. | Foram utilizados dez animais doadores de sêmen em nível de Central de Inseminação Artificial, da raça Gir, divididos em dois grupos, de acordo com o grau de congelabilidade do sêmen de cada animal. Os animais com sêmen de alta congelabilidade foram aqueles cuja porcentagem de ejaculados viáveis pós-descongelação foi superior a 80%. O grupo de baixa congelabilidade tinha animais com porcentagem menor que 50% de ejaculados viáveis pós-descongelação. Os critérios de avaliação da viabilidade do sêmen e seleção dos animais foram definidos pelo controle de qualidade do Departamento de Produção da Central de Inseminação Artificial. Foram feitas quatro coletas semanais consecutivas, sendo que obtiveram-se as amostras de plasma seminal por centrifugação a 1.500 g por 15 a 20 minutos a 4°C, momentos após a coleta do sêmen em vagina artificial. O plasma seminal foi dialisado em membrana de celulose, em tampão Tris-Glicina pH-7,4 por 24 horas a 4°C, em agitação lenta e constante. As amostras foram padronizadas em 1,0 mg/ml de proteína total, por diluição em tampão Tris-HCl 62mM pH-6,2 mais 20% de glicerol e 4% de SDS. Através de eletroforese do tipo SDS-PAGE, foram feitas as corridas em gel a 13%. A corrida foi feita com a constante de 25 mA, por um período de 5 horas. A coloração do gel foi feita por Coomassie Brilliant Blue. Pelos resultados obtidos, verificou-se que existe uma banda no grupo de alta congelabilidade, cujo fragmento polipeptídico desta proteína tem Mr (mobilidade relativa) 20,3 e PM (peso molecular) aproximado de 61.800 Da. Esta banda não foi detectada nas amostras do grupo de baixa congelabilidade, o que sugere ser um possível marcador bioquímico quanto ao potencial de criopreservação do sêmen de bovinos.