La brucelosis es una enfermedad zoonótica muy importante, considerada endémica en más de 170 regiones a nivel mundial, es una enfermedad primordialmente reproductiva que afecta la salud humana y animal, así mismo, afecta la economía nacional. Los bovinos son una fuente de proteína importante en México y el búfalo de agua es una alternativa para la demanda de proteína animal. En México, el búfalo fue ingresado en los años noventa y tiene presencia en casi todos los estados. Sin embargo, después de 30 años de ser ingresado a México se desconoce su situación epidemiológica frente a brucelosis. El objetivo fue estimar la frecuencia serológica de Brucella spp. en búfalos de agua de los estados de Campeche, Tabasco y Oaxaca, México. Se realizó un estudio transversal con muestreo no probabilístico, en el cual se analizaron 825 búfalos de agua originarios de 18 hatos bufalinos de dichos estados. Se realizaron pruebas de tarjeta como tamiz y rivanol como confirmatoria, se calcularon las frecuencias por estado y municipio. La frecuencia general fue de 4 % para la prueba de tarjeta y 3 % con rivanol, los tres estados tuvieron seropositivos y el 66.6 % de la UPB fueron seropositivas. La seroprevalencia puede cambiar a lo largo del tiempo y está relacionada con múltiples variables; sin embargo, el hallazgo de animales seropositivos en zona de erradicación es de importancia sanitaria, debido a que esta enfermedad se encuentra en campaña a nivel nacional.