Aislamiento de ADN de calidad para la amplificación al azar de adn polimórfico de mango

Inglés. In order to genetically characterize the different genotypes of the Mango Germplasm Collection of the National Center for Agricultural Research (INIACENIAP) through RAPD, conditions for DNA isolation from leaf tissue were adjusted. Tests for calibrating buffer extractions were done by comparing four lysis solutions and the initial conditions for incubating macerated tissue. Test to obtain optimal leaf tissue:lysis buffer ratio were performed. Also, DNA precipitation conditions, DNA pellet washing solutions and effect of liophylization on DNA pellet resuspension were studied. Of the four DNA extraction protocols studied, higher amounts of DNA were obtained with the Doyle and Doyle (1990) methodology. Best results were obtained by macerating 250 mg of leaf tissue with 900µl 2X CTAB-TRIS base lysis buffer, preheated at 60 °C. All the solution was incubated at 60 °C for 1 hr. Storing macerate at -20 °C for 24 hrs increased DNA precipitation when using cold 98% isopropanol. Washing pellets at 37 °C with 70% ethanol produced white sediments. Finally, improvements of resuspension of DNA pellet in TE buffer occurred when tissues were liophylized at 50 °C for 3 hrs. Methodology proved efficient to isolate DNA from all the studied varieties. DNA concentration was higher than 350ng/µl in all cases.

Español; castellano. Con la finalidad de caracterizar los distintos genotipos del Banco de Germoplasma de mango del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP) a través de RAPD, fueron ajustadas las condiciones para la extracción de ADN nuclear a partir de tejido foliar. Se realizaron pruebas para calibrar el buffer de extracción, comparándose 4 soluciones de lisis y las condiciones iniciales de incubación del tejido macerado. De igual manera se hicieron pruebas factoriales de niveles de pesos de tejido foliar y volumen de buffer de lisis y las condiciones de precipitación del ADN, lavado del sedimento final y efecto de la liofilización en la resuspensión del sedimento de ADN. De los 4 protocolos distintos de extracción, se obtuvo una mayor cantidad de ADN con la metodología desarrollada por Doyle y Doyle. Los mejores resultados se obtuvieron macerando 250 mg de tejido foliar joven en 900 µl de tampón CTAB 2X con Tris Base calentado a 60 °C, e incubando el macerado por 1 hora a la misma temperatura. El almacenamiento de las muestras a -20 °C hasta el día siguiente mejoró la precipitación del ADN al agregar isopropanol 98% frío. La incubación del ADN a 37 °C con la solución de lavado (etanol 70%) permitió obtener sedimentos blancos. Finalmente la resuspensión del sedimento de ADN se mejora al liofilizar los tejidos a -50 °C durante 3 h. La metodología probó ser eficiente con las variedades de mango, Mangifera indica L., estudiadas, permitiendo extraer ADN genómico en concentraciones superiores a 350 ng/µl en todos los casos.