Utilisation d’enzymes pectino-cellulolytiques pour améliorer l’extraction des virus à localisation phloémique : cas du « Rice tungro virus », complexe viral du riz

Le complexe viral du riz dénommé « Rice tungro virus complex » (RTV-C) localisé aux cellules du phloème, transmis principalement par les cicadelles du genre Nephotettix sur le mode semi-persistant, a été purifié suivant un protocole mettant en jeu l’action d’enzymes pectino-cellulolytiques. Les enzymes et les complexes enzymatiques (driselase, pectolyase Y-23, macérozyme R-10 ou cellulase « Onazuka » R-10) ont été utilisés seuls ou successivement sur les résidus fibreux obtenus après broyage et filtration de pousses de riz de la variété « Taichung Native 1 ». Les résidus fibreux sont homogénéisés dans un tampon citrate pH 6 en présence des enzymes pectino-cellulolytiques puis incubés en milieu agité pendant 2 h à 28 ± 1 °C. La fraction soluble est amenée à pH 7 et la purification des particules virales s’effectue de la façon suivante : après clarification de l’extrait par le chloroforme, deux ultra-centrifugations différentielles sont réalisées, la première est effectuée en présence d’un coussin de sucre. Pour les différentes conditions expérimentales, les quantités de virus obtenues sont comparées par la mesure de la surface des zones d’absorption à 260 nm des particules virales après leur migration dans un gradient de saccharose. Avec les différents systèmes enzymatiques utilisés pour les résidus fibreux, des accroissements notables (1,39 à 3,11) des rendements d’extraction du complexe viral sont obtenus à partir de ces résidus. L’action des trois systèmes enzymatiques suggère des effets complémentaires qui sont discutés. Ce type d’extraction enzymatique réservé aux résidus fibreux, décrit ici sur le RTV-C et antérieurement pour certains lutéovirus, devrait être applicable aux autres groupes de virus à localisation phloémique.

Rice tungro virus complex (RTV-C), consisting of tungro spherical and tungro bacilliform viruses, is phloemlimited and transmitted principally by leafhoppers Nephotettix spp. in a semi-persistent manner ; it has been successfully purified using pectino-cellulolytic enzymes. The enzymes (driselase, pectolyase Y-23, macerozyme R-10 and cellulase "Onazuka" R-10) were used alone or in different combinations on the fibrous residue obtained from the first grinding and filtration of RTV-C infected shoots of rice cultivar "Taichung Native-I". The fibrous residue was homogenized once or successively in citrate buffer pH 6 along with enzyme or a mixture of enzymes and incubated with shaking. The filtrate was adjusted to pH 7 and the virus particles were purified by clarifying extracts with chloroform, precipitation of virus by differential centrifugation and sucrose density gradients. The quantity of the virus-complex obtained from different experimental conditions was compared by the measurement of the surface of the absorption at 260 nm in sucrose density gradients. In the presence of the three enzyme systems utilized, a major increase (1.39 to 3.12 times) in the virus yield was obtained from the treatment of fibrous residue. The action of the enzymes utilized in these systems appears to be additive, and this point is discussed. The enzyme method described here and earlier for some luteoviruses may be useful for extraction and purification of other phloem-limited viruses.