Der entomopathogene Pilz Metarhizium robertsii und sein endophytisches Potential in der Weinrebe zur Regulierung der radicicolen Reblauspopulation | The entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii and its endophytic potential in grapevine to regulate radicicole grape phylloxera populations | Le champignon entomopathogène Metarhizium robertsii et son potentiel endophyte sur vigne pour réguler les populations de phylloxéra radicicole

Alemán. Die Reblaus Daktulosphaira vitifoliae zerstörte bis zum Ende des 19. Jahrhunderts 30 % der europäischen Weinberge, indem sie die älteren, holzigen Wurzeln von wurzelechten, nicht gepfropften Weinreben (Vitis vinifera (L.)) angriff. Bis heute ist das Aufpfropfen von Weinreben auf amerikanische, Reblaus-resistente Unterlagsreben die verbreitetste Lösung zur Bekämpfung dieses Schädlings. Die Reblaus ist jedoch in Böden fast aller Weinbaugebiete vorhanden und stellt in Regionen, in denen nicht gepfropfte Reben angebaut werden, weiterhin eine Gefahr dar. Daher werden alternative Bekämpfungsmöglichkeiten untersucht. Der entomopathogene Pilz Metarhizium robertsii ist für seine Fähigkeit bekannt, Insekten zu parasitieren. Neben seiner entomopathogenen Eigenschaft kann der Pilz die Rhizosphäre von Pflanzen besiedeln und sich als Endophyt (d. h. im Pflanzengewebe) in einer Vielzahl von Pflanzenarten etablieren. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte untersucht werden, ob sich M. robertsii dauerhaft in der Rhizosphäre und als Endophyt auf nicht gepfropften, wurzelechten Weinreben ansiedeln kann, und die Entwicklung der radicicolen Form der Reblaus verhindert wird, ohne das Wachstum der Weinrebe zu beeinträchtigen. Es wurde eine Auswahl von vier M. robertsii-Stämmen verwendet, die in vier verschiedenen Weinbaugebieten beheimatet sind: i) im mittleren Westen Argentiniens (Stamm MsoilAR4.3), ii) im Süden Australiens (Stamm M224B), iii) im Südwesten Frankreichs (Stamm EF3.5(2)) oder iv) im westen Deutschlands (Stamm EF047). Mit Hilfe künstlicher Inokulationsmethoden wurde in Gewächshaus-Experimenten die Assoziation zwischen M. robertsii und nicht veredelten Topfreben (Cv Cabernet Sauvignon) untersucht. Zunächst wurde die Besiedlung der Reben-Rhizosphäre und -Endosphäre durch den Stamms EF3.5(2) mit der durch einen nicht im Weinberg heimischen Laborstamm (ARSEF-2575-GFP), verglichen, um festzustellen, ob ein im Weinberg heimischer Stamm zu einer dauerhafteren Besiedlung der Rebe führt. Mit Hilfe von Droplet Digital PCR (ddPCR), einer kulturbasierten Methode und konfokaler Bildgebung von Wurzelsegmenten zur Bewertung der Assoziationen wurde festgestellt, dass der im Weinberg heimische Stamm eine bessere Etablierung in der Rhizosphäre und Wurzel-Endosphäre aufwies als der Stamm ARSEF-2575-GFP. Beide Stämme waren für bis zu 96-98 Tage nach der Inokulation (days post-inoculation, dpi) noch in beiden Kompartimenten etabliert. Anschließend wurden die aus vier unterschiedlichen Weinbauregionen stammenden M. robertsii-Stämme hinsichtlich ihres Assoziationspotenzials mit nicht veredelten Weinreben verglichen. Es zeigte sich, dass der Anteil an Pflanzen mit erfolgreich besiedelter Rhizosphäre nach 68- 70 dpi zwischen 60 % für den argentinischen Stamm MsoilAR4.3, 65 % für den australischen Stamm M224B, 76,2 % für den französischen Stamm EF3.5(2) und 100 % für den deutschen Stamm EF047 lag. Die Besiedlungsrate der Wurzel-Endosphäre betrug 14,3 %, 9,5 %, 4,8 % bzw. 33,3 % nach 68-70 dpi. Zwischen den getesteten Stämmen wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Besiedlung der Rhizosphäre und der Wurzel-Endosphäre festgestellt. Die Pilzassoziation hatte auch keinen Einfluss auf das Wachstum der Rebe und den Pigmentgehalt der Blätter während des Versuchszeitraums. Schließlich wurde der Einfluss von direktem Parasitismus des Stammes EF3.5(2) auf das Überleben und die Entwicklung des radikalen Reblausklons 'Pcr7' in einem Bioassay mit holzigen Wurzelabschnitten untersucht. Abhängig von der Methode, mit der das Insekt infiziert worden war, wurde eine signifikante Verringerung der Überlebenswahrscheinlichkeit um 90 %, 70% und 86,1 % sowie eine Verringerung der Entwicklung von adulten Tieren um 92 %, 89 % und 93 % im Vergleich zur Kontrollbehandlung festgestellt. [...]

Inglés. Grape phylloxera Daktulosphaira vitifoliae destroyed 30% of the European vineyard by the end of the 19th century, attacking the woody roots of the grapevine Vitis vinifera (L.). To date, grafting grapevine on American resistant rootstocks is the leading solution to control the pest. However, grape phylloxera is present in most wine-growing soils and remains a threat in regions planted with non-grafted vines. Thus, alternative control solutions are investigated. The entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii is known for its capacity to parasitize insects. Besides, the fungus can colonize plant rhizosphere and establish as an endophyte (i.e., within plant tissues) in many plant species. The thesis aimed to investigate if M. robertsii could persistently associate with the rhizosphere and as an endophyte in non-grafted grapevine V. vinifera without harming its growth while preventing the development of the grape phylloxera radicicole forms.Four M. robertsii strains native to four different vineyards were used and came from: i) the center-West Argentina (MsoilAR4.3), ii) the south of Australia (M224B), iii) the south-west of France (EF3.5(2)) and iv) the west of Germany (EF047). Greenhouse experiments were conducted to assess the association between M. robertsii and potted non-grafted grapevines. First, the comparison of the kinetic of grapevine rhizosphere and endosphere colonization was made, comparing the strain EF3.5(2) with a laboratory strain non-native to the vineyard (ARSEF-2575-GFP) to evaluate if a vineyard-native strain had a more durable colonization. Droplet Digital PCR (ddPCR), a culture-based method, and confocal imaging of root segments were used to characterize the associations. The strain EF3.5(2) had a higher establishment in the rhizosphere and root-endosphere of non-grafted grapevine than the strain ARSEF-2575-GFP. Both strains were established for up to 96-98 days post-inoculation (dpi) in both compartments. Then, the potential of association with the non-grafted grapevine of all four-vineyard native M. robertsii strains was compared. The rates of rhizospheric colonization at 68-70 dpi ranged from 60% for the Argentinian MsoilAR4.3 strain, 65% for the Australian M224B strain, 76% for the French EF3.5(2) strain, to 100% for the German EF047 strain. The rates of root endosphere colonization were 14%, 10%, 5%, and 33% at 68-70 dpi, respectively. No significant differences of rhizosphere and root-endosphere colonization between tested strains were recorded. Also, the fungal association unaffected the grapevine's growth and leaf pigment content during the experimental period. Finally, the effect of direct parasitism of the strain EF3.5(2) on the survival and development of radicicole grape phylloxera clone 'Pcr7' was evaluated in the woody root section bioassay. Depending on the method used to infect the insect, a significant reduction of 90 %, 70 %, and 86% in survival probability was found, and 92%, 89%, and 93 % in reduction of adults' development compared with control treatments. Also, the symptoms induced by grape phylloxera on non-grafted grapevines co-inoculated with M. robertsii were reduced by 91% (mean of 4.8 ± 8.4 nodosities) compared with the phylloxera infested-plants (mean of 52.7 ± 50.7 nodosities). The qPCR analysis performed on grapevine inoculated with strain EF3.5(2) showed after 24h, the up-regulation of the VvWRKY-75, VvPR3.2, VvPR4, and VvG1, which are phylloxera-responsive defense genes involved in the resistance against phylloxera.In conclusion, M. robertsii’s persistent association with non-grafted grapevine represents an alternative protection strategy against radicicole grape phylloxera, especially for wine-growing regions planted with non-grafted vines. Further field experiments should be carried out to determine the environmental factors affecting the effectiveness and persistence of M. robertsii associated with grapevine.

Francés. Le phylloxéra Daktulosphaira vitifoliae a détruit 30 % du vignoble européen à la fin du 19e siècle, en s'attaquant aux racines de la vigne Vitis vinifera (L.). À ce jour, le greffage des vignes sur des porte-greffes américains résistants est la principale solution de protection contre ce ravageur. Pourtant, le phylloxéra est présent dans la plupart des sols viticoles et reste une menace dans les régions viticoles non greffées. C'est pourquoi d'autres solutions de lutte sont étudiées. Le champignon entomopathogène Metarhizium robertsii est connu pour sa capacité à parasiter les insectes. En outre, il peut coloniser la rhizosphère de plusieurs espèces végétales et s'établir en tant qu'endophyte. Cette thèse visait à étudier si M. robertsii pouvait s'associer durablement à la rhizosphère et en tant qu'endophyte à la vigne non greffée sans nuire à sa croissance, tout en empêchant le développement des formes radicicoles du phylloxéra.Quatre souches M. robertsii originaires de différents vignobles ont été étudiées en provenance de: centre-ouest de l'Argentine (MsoilAR4.3), sud de l'Australie (M224B), sud-ouest de la France (EF3.5(2)), ouest de l'Allemagne (EF047). Des essais en serre ont été menés pour évaluer leur association à des vignes en pot non greffées après inoculation. La comparaison des cinétiques de colonisation de la rhizosphère et de l'endosphère de la vigne a été réalisée entre la souche EF3.5(2) et une souche de laboratoire, non originaire du vignoble (ARSEF-2575-GFP). Le potentiel de colonisation par la souche EF3.5(2) était supposé supérieur et plus durable dû à son origine. La Droplet Digital PCR, la mise en culture de tissus végétaux, et l'imagerie confocale de segments racinaires ont permis de caractériser ces associations. La souche EF3.5(2) a été plus détectée dans la rhizosphère et l'endosphère racinaire de la vigne non greffée que la souche ARSEF-2575-GFP. Les deux souches se sont établies jusqu'à 96-98 jours après inoculation (dpi) dans les deux compartiments. Le potentiel d'association avec la vigne non greffée des souches originaires des quatre vignobles a ensuite été comparé. La colonization rhizosphérique à 68-70 dpi était de 60% des plants testés pour la souche argentine MsoilAR4.3, 65% pour la souche australienne M224B, 76% pour la souche française EF3.5(2), à 100% pour la souche allemande EF047. De même, les taux de colonisation de l'endosphère racinaire étaient respectivement de 14 %, 10 %, 5 % et 33 % à 68-70 dpi. Les souches testées se sont établies sans différences significatives dans les deux compartiments. De plus, l'inoculation n'a pas affecté la croissance de la vigne et la teneur en pigments des feuilles pendant l’essai. Enfin, l’effet du parasitisme direct de la souche EF3.5(2) sur la survie et le développement du phylloxéra radicicole clone 'Pcr7' a été évalué sur tronçons de racines ligneuses. En fonction de la méthode utilisée pour infecter l'insecte, une réduction de 90 %, 70 % et 86 % de la probabilité de survie a été quantifiée et de 92 %, 89 % et 93 % du développement des adultes par rapport aux 3 traitements contrôles. De même, les symptômes induits par le phylloxéra sur les vignes non greffées co-inoculées avec M. robertsii ont été réduits de 91% par rapport aux vignes contrôles. De plus, l'analyse qPCR réalisée sur la vigne inoculée avec la souche EF3.5(2) montre, après 24h, l’induction des 4 gènes impliqués dans la résistance contre phylloxéra.En conclusion, l'association durable de M. robertsii avec des vignes non greffées représente une stratégie alternative de protection contre le phylloxéra radicicole, notamment pour les régions viticoles non greffées. Des futures expériences en vignoble devraient être réalisées afin de déterminer les facteurs environnementaux affectant la persistance et l’efficacité de M. robertsii associé à la vigne.