Mutagénesis insercional mediada por recombinación homóloga en el hongo Trichoderma atroviride

El hongo Trichoderma atroviride tiene un genoma atractivo para estudiar micoparasitismo, metabolismo y fotomorfogénsesis, debido a sus características biológicas distintivas como capacidad antagonista contra hongos fitopatógenos, amplio repertorio enzimático, conidiación inducida por luz azul y un efecto promotor de crecimiento en plantas. Análisis genómicos han mostrado genes clave para comprender procesos evolutivos, incluyendo micoparasitismo e interacciones recíprocas hongo-planta. Hasta la fecha, se han desarrollado y mejorado diversas herramientas genéticas con el objetivo de descubrir funciones de genes en hongos filamentosos, a pesar de eso la identificación de los genes mutados sigue siendo un cuello de botella en las estrategias de genómica funcional. En este trabajo, desarrollamos una nueva estrategia de mutagénesis, basada en la integración plasmídica por recombinación homóloga, facilitando la identificación de los genes interrumpidos. El plásmido pCB1004 fue utilizado para construir una biblioteca genómica, la cual contenía fragmentos de ADN de T. atroviride con tamaños entre 0.75 y 1.5 kbp. Después de dos pases monospóricos de cepas transformantes en medio selectivo con higromicina B, se realizaron pruebas de estabilidad para el marcador de selección, revelando que 224 de 800 transformantes resultaron estables, sugiriendo la integración del plásmido en el genoma en el 28% de las transformantes. En orden de determinar la identidad de las inserciones del plásmido, se implementó un nuevo enfoque de identificación a través de PCR y secuenciación. Los resultados indicaron que las inserciones ocurrieron mayoritariamente en eventos independientes únicos y dobles, distribuidas al azar a través del genoma de T. atroviride. La caracterización fenotípica de las transformantes a estrés metabólico, daño mecánico y ensayos de fotoinducción permitió determinar funciones génicas previamente no descritas en cepas mutantes con un crecimiento muy reducido (ID proteínas: 52977 unión a metales de transición, 143930 modificación y procesamiento de RNA, 317064 actividad de transporte, 33929 remodelación de la cromatina, 298021 función desconocida y 233373 actividad de transporte) y afectadas en fotoconidiación (48079 péptido sintetasa no ribosomal, 81320 actividad catalítica, 39327 actividad de transporte, 173440 plegamiento de proteínas, 307447 ubiquitina ligasa y factor de corte y empalme del ARNm ). En conjunto, nuestros datos proveen evidencia del potencial promisorio de esta estrategia de mutagénesis, siendo una de sus mejores bondades la rapidez y facilidad para identificar el gen afectado.