Avaliação in vitro de sêmen criopreservado de bovino e sua correlação com fertilidade in vivo | In vitro evaluation of cryopreserved bovine semen and its correlation with in vivo fertility

Um dos problemas mais importantes da indústria da inseminação artificial é a determinação do potencial de fertilidade do sêmen, pois, as metodologias convencionais utilizadas para avaliar a qualidade de sêmen não têm demonstrado boa correlação com fertilidade dos espermatozoides. Resultados de recentes estudos com sêmen congelado-descongelados quando submetidos a uma filtragem antes das avaliações espermáticas tem melhor correlação entre as características dos espermatozoides e a fertilidade in vivo. Além disso, a utilização de diferentes sondas fluorescentes nas análises do sêmen permitem avaliação ampla e individual dos espermatozoides, além de sua qualidade funcional, bioquímica e estrutural. Desde modo, o presente estudo teve como objetivo empregar diferentes testes complementares de avaliação espermática pré e pós-filtragem em solução coloidal de sêmen criopreservado e verificar sua correlação com a fertilidade in vivo. Foram utilizadas duas amostras (palhetas da mesma partida) de sêmen congelado de 18 touros doadores de sêmen, sendo 11 reprodutores da raça Nelore, cinco Composto Montana Tropical, um Senepol, e um Red Angus, escolhidos de acordo com os animais utilizados em programa de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) imposto em um rebanho comercial. Os dados obtidos foram divididos de acordo com a fertilidade obtida após as inseminações, sendo fertilidade satisfatória (≥ 55 % de taxa de prenhez) e fertilidade insatisfatória (˂ 55 % de taxa de prenhez) Todas as fêmeas foram sincronizadas por uso de protocolos de sincronização e inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Os testes empregados para análise do sêmen foram motilidade e vigor espermático, análise quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, produção de peróxido de hidrogênio intracelular, e organização da bicamada, por meio de sondas fluorescentes (IP, FITC-PSA, M540) empregando a Citômetria de fluxo. Houve efeito de touro sobre a taxa de prenhez (P<0,05) com máximo de 76 % (19/25) e mínimo de 15,6 % (5/32) sendo a média de 54,6 % (723/1325) de prenhez com uma inseminação. Quanto aos grupos de fertilidade houve diferença (P<0,05) entre as médias, sendo 62 % de prenhez para o grupo FERTILIDADE SATISFATÓRIA e 40,6 % para o grupo FERTILIDADE INSATISFATÓRIA. Na avaliação convencional do sêmen, o grupo de fertilidade satisfatória apresentou maior média de motilidade espermática progressiva retilínea (60,49%) que o grupo de fertilidade insatisfatória. Nas avaliações realizadas por citometria de fluxo, o grupo de fertilidade insatisfatória obteve maiores médias percentuais para populações celulares com membrana plasmática lesionada e membrana acrossomal intacta (7,18 %), para células com alto grau de peroxidação e lesão de membrana plasmática (25,5 %) e menor média percentual de populações celulares com membrana plasmática íntegra e estável (19,5 %) que diferiram (p<0,05) do grupo e fertilidade satisfatória. A centrifugação do sêmen em solução coloidal foi eficiente em reter as células com lesões na membrana plasmática e células com lesões na membrana acrossomal (16,8; 31,9 e 7,0 %); células com alta peroxidação intracelular (4,17; 64,3 e 15,0 %). Concluiu-se que as populações de espermatozóides com lesão na membrana acrossomal representam o maior percentual das células espermáticas em sêmen submetido ao processo de congelamento e relacionam-se com à alta taxa de fertilidade obtida em programa de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); populações de espermatozóides com lesão de membrana plasmática e alta taxa de peroxidação intracelular estão relacionadas à baixa taxa de fertilidade em programas de inseminação artificial em tempo fixo (IATF); a seleção de espermatozoides com membranas acrossomal e espermática intactas é possível pela centrifugação associado ao uso de soluções coloidais (Androcoll®) e a avaliação da motilidade espermática progressiva retilina está relacionada a alta taxa de fertilidade em programa de inseminação artificial em tempo fixo.

One of the most important problems of the artificial insemination industry is the determination of semen fertility potential for the conventional methods used to assess the quality of semen have not shown good correlation with fertility of sperm. Results of recent studies with frozen-thawed semen when subjected to filtering before the spermatic reviews have better correlation between the characteristics of sperm and fertility in vivo. In addition, the use of different fluorescent probes in semen analysis allow for a wide and individual assessment of sperm, as well as its functional, biochemical and structural. In this way, the present study aims to employ different complementary tests pre sperm and post-filtering in colloidal solution and check its correlation with fertility in vivo semen. Two samples were used (vanes in the same match) frozen semen of 18 donor bulls semen, 11 breeding Nelore five Composite Montana Tropical, one Senepol, and Red Angus, chosen according to the animals used in program Fixed-Time Artificial insemination (FTAI). It was previously established that the data obtained would be divided into fertility group, being satisfactory (≥ 55% pregnancy rate) and unsatisfactory (˂ 55% pregnancy rate) All females were synchronized by using synchronization protocols and fixed-time artificial insemination (FTAI). For data analysis of semen were motility and sperm vigor, analysis of the integrity of plasma and acrosomal membrane of intracellular hydrogen peroxide production, and organization of the bilayer by means of fluorescent probes (IP FITC-PSA, M540) in flow cytometer. There was bull effect on the pregnancy rate (P<0.05) with a maximum of 76% (19/25) and a minimum of 15.6% (5/32) with a mean of 54.6% (723/1325 ) of pregnancy. As for fertility groups difference (P <0.05) between the average, 62% of pregnancy for SATISFACTORY group and 40.6% for UNSATISFACTORY group. In conventional semen evaluation, the satisfactory group showed higher mean rectilinear motility (60.49%) than the poor group. In the assessments performed by flow cytometry, the UNSATISFACTORY group had higher average percentage for cell populations with damaged plasma membrane and intact acrosome membrane (7.18%; IP + PSA-) for cells with a high degree of peroxidation and plasma membrane injury (25.5%; DCFDA + PI +) and lower mean percentage of cell populations with full and stable plasma membrane (19.5% M540-6DCFDA +) that differed (p <0.05) SATISFACTORY group. The centrifugation of semen in colloidal solution was efficient in retaining the cells with lesions in the plasma membrane and cell injuries in the acrosome membrane (16.8% IP + PSA-; 31.9%, IP + PSA +, 7.0% IP-PSA +); cells with high intracellular peroxidation (4.17% DCFDA-PI +; 64.3% DCFDA + PI + 15.0%, + DCFDA PI). It was concluded that the populations of sperm with injury acrosome membrane represent the highest percentage of sperm cells in semen subjected to the freezing process and are related to the high fertility rate obtained in fixed-time artificial insemination (FTAI); sperm populations of plasma membrane damage and high intracellular peroxidation rate represent the highest percentages of sperm populations of cryopreserved semen, and are related to low fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI); the selection of sperm with intact acrosome and sperm membranes is possible by centrifugation associated with the use of colloidal solutions (Androcoll®) and evaluation of sperm motility by light microscopy is related to high fertility rate in fixed-time artificial insemination (FTAI) program.