Diagnosis of failure of passive transfer in dairy calves and procedures after calving to improve harvesting of high-quantity and high-quality colostrum | Diagnostik der fehlerhaften passiven Immunisierung bei Milchkälbern mit mangelhafter Kolostrum-Versorgung und Verfahren zur Verbesserung der Kolostrum-Qualität und -Menge nach der Kalbung

The overall objectives of this thesis were (1) to evaluate a filter system to harvest plasma for identification of failure of passive transfer in newborn calves, (2) to evaluate 2 different treatment procedures after calving to improve harvesting of high-quantity and high-quality colostrum, and (3) to evaluate different analytical methods to assess failure of passive transfer in neonatal calves. To validate a filter system to harvest plasma for the assessment of failure of passive transfer (FPT) in neonatal calves, venous blood samples (serum and plasma) were withdrawn from 227 Holstein Friesian calves aged 1 to 7 d. Serum IgG concentrations were determined using a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (gold standard), and failure of passive transfer was defined as IgG concentrations below 10 mg/mL. Serum was obtained through centrifugation, and plasma was extracted either through centrifugation or a disposable filter system (2-Drop-Filter, Pharmadoc, Lübeck, Germany). To assess the total proteins (TP) and total solids (TS) in serum and plasma, a handheld optical refractometer (Euromex Holland, Arnhem, the Netherlands) and 2 digital Brix refractometers (device 1: HI 96801 digital refractometer, Hanna Instruments, Woonsocket, RI; device 2: Misco PA201, Misco, Solon, OH) were used. The optimal threshold for each device and each medium, i.e centrifuged serum, centrifuged plasma, and filtered plasma, was calculated using the receiver operating characteristic (ROC) curve analyses. The prevalence of failure of passive transfer in neonatal calves was 30% (67/227). The optimal threshold for the handheld optical refractometer using serum was 5.6 g/dL [sensitivity (Se) 70.1%; specificity (Sp) 80.0%; area under the curve (AUC) 0.85]. For centrifuged plasma, the optimal threshold was higher at 6.3 g/dL (Se 82.1%; Sp 68.1%; AUC 0.84), and for filtered plasma, the threshold was 6.0 g/dL (Se 56.7%; Sp 90.0%; AUC 0.80). The digital Brix refractometer (device 1: HI 96801) had the optimal threshold at 8.9% Brix using serum (Se 82.1%; Sp 63.8%; AUC 0.81), and at 9.4% Brix (Se 76.1%; Sp 73.7%; AUC 0.80) using centrifuged plasma, respectively. The device 2 (Misco PA201) determined the optimal threshold at 8.7% Brix (Se 74.6%; Sp 76.2%; AUC 0.83), 9.5% Brix (Se 80.6%; Sp 70.6%; AUC 0.83), and 9.2% Brix (Se 58.2%; Sp 87.5%; AUC 0.80) using serum, centrifuged plasma, and filtered plasma, respectively. All the three devices with the different media had comparable test characteristics to assess calves with FPT, based on the AUC determined with ROC curve analyses. Plasma samples (centrifuged and filtered plasma) revealed higher optimal thresholds to assess FPT compared with serum. Furthermore, the three different devices had comparable AUC irrespective of the used medium (centrifuged serum, centrifuged plasma, or filtered plasma). The results demonstrate that a filter system is suitable as a point-of-care analysis for FPT assessment, but further research is necessary. The aim of the second study was to evaluate two different treatment procedures at first milking after calving to increase colostrum quantity and to improve colostrum quality in dairy cows. We assumed that exogenous treatment with oxytocin or the presence of the calf at harvesting the first colostrum would lead to higher colostrum quantity and higher IgG concentrations. For the study, a total of 567 dairy cows were enrolled. For the final analyses, only 521 animals were considered and 46 dairy cows were excluded due to several reasons, such as lameness, bloody or mastitic colostrum, gestation length of less than 265 d, twin births and missing data. Three groups were built in which the cows were randomly assigned on a daily basis: (1) control group (CON; n = 177), (2) application of 20 IU of oxytocin i.m. (OXY; n = 163), and (3) presence of the calf (CA; n = 181) before and during milking. The milking of the first colostrum took place in a separate milking parlor. Dairy cows in the control and oxytocin group had no contact with their calves after calving. Three minutes before manual stimulation, the cows in the oxytocin group were injected with 20 IU of oxytocin i.m. into the neck region. Cows in the CA group got their calf presented three minutes before milking, whereby the calf was placed into a calf cart and located in front of the cow. Colostrum quantity (kg) was recorded and colostrum quality was determined by Brix refractometry and ELISA. To evaluate the data a generalized linear mixed model (GENLINMIXED) was constructed using SPSS (SPSS Inc., IBM, Ehningen, Germany). The mean colostrum quantity was 4.17 ± 0.30 kg (means ± SE). The treatment procedures and the harvesting time after calving did not affect colostrum quantity, but parity, calf birth weight, and calving time had an influence on colostrum quantity. The lowest quantity of colostrum had cows in second parity (3.74 ± 0.37 kg). Whereas cows in parity 1 (4.75 ± 0.34 kg) and cows in parity 3 or greater (4.75 ± 0.38 kg) had higher colostrum quantities. Further, cows calving at night (22:00 until 06:00 h; 4.93 ± 0.37 kg) had the highest quantity of colostrum. Cows calving in the morning (06:00 until 14:00 h; 4.17 ± 0.38 kg) or afternoon (14:00 until 22:00 h; 4.14 ± 0.34 kg) had a reduced amount of colostrum. Forty-eight percent of the colostrum samples assessed by ELISA contained ≥ 50 mg IgG/mL (54.6 ± 2.80 mg IgG/mL). The treatment procedures had an effect on colostrum quality, as well as colostrum quantity, parity, calving time, harvesting time after calving, and the calving day during the week. The treatment procedures achieved on mean higher IgG concentrations in colostrum (OXY: 57.0 mg IgG/mL; CA: 56.0 mg IgG/mL) compared with the control group (50.7 mg IgG/mL). High colostrum quantity and a longer time lag between calving and milking decreased the colostrum quality. Cows in parity 3 or greater (64.6 ± 2.59 mg IgG/mL) had higher IgG concentrations compared with cows in parity 1 (48.5 ± 2.86 mg IgG/mL) and cows in parity 2 (50.7 ± 2.89 mg IgG/ mL). Calving at night resulted in greater IgG concentrations (60.4 ± 2.92 mg IgG/mL) compared to calving at the morning or afternoon time (51.9 ± 2.98 and 51.3 ± 2.71 mg IgG/mL). Calving on Sundays increased the colostrum quality (61.4 ± 3.70 mg IgG/mL). The treatment procedures and the harvesting time after calving had no effect on colostrum quality assessed by Brix refractometry. Nevertheless, a negative association was observed between colostrum quantity and quality as with ELISA testing. Cows in parity 3 or greater showed higher Brix readings (27.7 ± 0.26% Brix) compared with cows in parity 1 (25.3 ± 0.30% Brix) and cows in parity 2 (25.0 ± 0.32% Brix). The purpose of the third study was to evaluate different analytical methods [i.e., ELISA, capillary electrophoresis (CE), refractometry] and three different media (i.e., centrifuged serum, centrifuged plasma, filtered plasma) to assess FPT in neonatal calves. As gold standard, radial immunodiffusion (RID) was chosen, and as before, FPT was defined by serum IgG concentrations < 10 mg/mL. Blood samples were collected from Holstein Friesian calves (n = 216) aged 1 to 7 days, from two commercial dairy herds in Northeast Germany. Serum was gained through centrifugation, and plasma extraction was performed either through a filter system or through centrifugation, as in the first study. For plasma filtration a disposable plasma filter was used (2-Drop-Filter, Pharmadoc, Lübeck, Germany). The laboratory methods, RID, ELISA, and CE, determined the IgG concentration in serum samples. For refractometry, two refractometers were used, a handheld optical refractometer (RF.5612 Handheld refractometer, Euromex Holland, Arnhem, Netherlands), assessing the TP concentration in all three media, and a digital Brix refractometer (Misco PA201, Misco, Solon, OH), assessing the TS, respectively. The RID analysis showed a prevalence of FPT of 27% (59/216) and 73% (157/216) with successful passive transfer. The Pearson correlation coefficient between RID and CE in serum was r = 0.97, and between RID and ELISA, it was r = 0.90, respectively. In addition, a high correlation between CE and ELISA could be identified (r = 0.89). Refractometry results were highly correlated with RID using either centrifuged serum, centrifuged plasma, or filtered plasma (Brix refractometer: r = 0.84; r = 0.80; r = 0.78; handheld optical refractometer: r = 0.83; r = 0.81; r = 0.80). The test characteristics to identify calves with FPT (optimal thresholds, Se, Sp, positive predictive value [PPV], negative predictive value [NPV], and AUC) for all methods and the three different media were determined by ROC curve analyses by using RID as the reference value. In summary, all four different analytical methods were suitable to assess FPT (ELISA, CE, and two refractometry methods). The test accuracy within the direct laboratory methods and within the indirect on-farm devices was very good, as the 95% CI for AUC overlapped, regardless of the three different media (centrifuged serum and plasma, or filtered plasma). However, different cutoff values for each analytical method must be considered, in particular if different media were used. The results demonstrate again, as in the first study, that optimal thresholds using plasma were higher compared with serum. In conclusion, all methods can be used for the assessment of FPT, and serum and plasma samples can be used interchangeably if the different cutoff values are taken into consideration. Overall, this thesis shows that (1) a disposable plasma filter system is appropriate as a point-of-care system for FPT analysis, but further research is required, (2) exogenous oxytocin and the presence of the calf improve the IgG concentration in colostrum at the first milking, but do not have an influence on colostrum quantity, and (3) different analytical methods are suitable to assess FPT if different cutoff values are taken into account. These results have the potential to improve colostrum management and calf health on dairy farms.

Die Ziele dieser Arbeit waren (1) ein Filtersystem zur Gewinnung von Plasma zu evaluieren, um eine fehlerhafte passive Immunisierung von neugeborenen Kälbern bedingt durch mangelhafte Kolostrum-Versorgung zu beurteilen. Des Weiteren (2) zwei verschiedene Behandlungsverfahren nach dem Abkalben zu untersuchen, um die Kolostrum-Menge und Kolostrum-Qualität zu verbessern. Sowie (3) verschiedene Analysemethoden zur Beurteilung der fehlerhaften passiven Immunisierung durch mangelhafte Kolostrum-Versorgung von neugeborenen Kälbern zu bewerten. Um ein Filtersystem zur Plasmagewinnung für die Beurteilung der fehlerhaften passiven Immunisierung bzw. Transfers (FPT) bei neugeborenen Kälbern zu validieren, wurden venöse Blutproben untersucht. Serum- und Plasmaproben wurden von 227 Kälbern der Rasse Holstein Friesian im Alter von ein bis sieben Lebenstagen entnommen. Die IgG-Konzentration im Serum wurde als Goldstandard mittels Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Alle Kälber mit IgG-Konzentrationen < 10 mg/mL im Serum waren von FPT betroffen. Serum wurde durch Zentrifugation gewonnen und Plasma wurde entweder durch Zentrifugation oder durch ein Einweg-Filtersystem (2-Drop-Filter, Pharmadoc, Lübeck, Deutschland) extrahiert. Um das Totalprotein (TP) und die Gesamtfeststoffe (TS) im Serum und Plasma zu bestimmen, wurden ein tragbares optisches Refraktometer (Euromex Holland, Arnhem, Niederlande) und zwei digitale Brix-Refraktometer (Gerät 1: HI 96801 digitales Refraktometer, Hanna Instruments, Woonsocket, RI; Gerät 2: Misco PA201, Misco, Solon, OH) verwendet. Der optimale Grenzwert für jedes Gerät und jedes Medium, d.h. für zentrifugiertes Serum, zentrifugiertes und gefiltertes Plasma, wurde anhand der ROC-Kurven-Analyse (Receiver Operating Characteristics) berechnet. Die Prävalenz von FPT bei neugeborenen Kälbern befand sich bei 30 % (67/227). Der optimale Grenzwert für das optische Refraktometer betrug 5,6 g/dL im Serum (Sensitivität [Se] 70,1 %; Spezifität [Sp] 80,0 %; Fläche unter der Kurve [AUC] 0,85). Für zentrifugiertes Plasma lag der optimale Grenzwert höher, bei 6,3 g/dL (Se 82,1 %; Sp 68,1 %; AUC 0,84) und für gefiltertes Plasma lag er bei 6,0 g/dL (Se 56,7 %; Sp 90,0 %; AUC 0,80). Das digitale Brix-Refraktometer (Gerät 1: HI 96801) zeigte den optimalen Grenzwert von 8,9 % Brix im Serum (Se 82,1 %; Sp 63,8 %; AUC 0,81) und 9,4 % Brix (Se 76,1 %; Sp 73,7 %; AUC 0,80) im zentrifugierten Plasma an. Das zweite Gerät (Misco PA201) hatte den optimalen Grenzwert von 8,7 % Brix im Serum (Se 74,6 %; Sp 76,2 %; AUC 0,83), 9,5 % Brix im zentrifugierten Plasma (Se 80,6 %; Sp 70,6 %; AUC 0,83) und 9,2 % Brix im gefilterten Plasma (Se 58,2 %; Sp 87,5 %; AUC 0,80). Alle drei Geräte mit den verschiedenen Medien hatten vergleichbare Testeigenschaften, um Kälber mit FPT zu beurteilen, basierend auf der AUC, die mit der ROC-Kurven-Analyse bestimmt wurde. Plasmaproben (zentrifugiertes und gefiltertes Plasma) hatten höhere optimale Grenzwerte zur Beurteilung von FPT im Vergleich zu Serumproben. Darüber hinaus zeigten die drei verschiedenen Geräte unabhängig vom verwendeten Medium (zentrifugiertes Serum, zentrifugiertes oder gefiltertes Plasma) vergleichbare AUC. Aus den Ergebnissen lässt sich schließen, dass ein Filtersystem als Point-of-Care-Analyse für die FPT-Bewertung geeignet ist, aber weitere Forschung dazu notwendig ist. Das Ziel der zweiten Studie war es, zwei verschiedene Behandlungsverfahren beim ersten Melken nach dem Kalben zu bewerten, um die Kolostrum-Menge und die Kolostrum-Qualität bei Milchkühen zu verbessern. Unsere Hypothese lautete, dass eine Behandlung mit Oxytocin oder das Vorhandensein des Kalbes beim ersten Melken nach der Kalbung zu einer höheren Kolostrum-Menge und zu einer höheren IgG-Konzentration führt. In die Studie gingen insgesamt 567 Milchkühe ein. Für die endgültige Auswertung wurden aber nur 521 Tiere berücksichtigt, da 46 Milchkühe aus verschiedenen Gründen ausgeschlossen wurden, z.B. Lahmheit, blutiges oder entzündlich verändertes Kolostrum, Trächtigkeitsdauer unter 265 Tagen, Zwillingsgeburten und fehlende Daten. Es wurden drei Gruppen gebildet, denen die Kühe täglich zufällig zugeordnet wurden: (1) Kontrollgruppe (CON; n = 177), (2) Anwendung von 20 IE Oxytocin i.m. (OXY; n = 163) und (3) Vorhandensein des Kalbes (CA; n = 181) vor und während des Melkens. Das Melken des ersten Kolostrums erfolgte in einem separaten Melkstand. Milchkühe in der Kontroll- und Oxytocingruppe hatten nach dem Kalben keinen Kontakt zu ihren Kälbern. Drei Minuten vor der manuellen Stimulation wurde den Kühen der Oxytocingruppe 20 IE Oxytocin i.m. in die Halsregion injiziert. Den Kühen der CA-Gruppe wurde drei Minuten vor dem Melken ihr Kalb präsentiert, wobei das Kalb in eine Transportkarre für Kälber gelegt und vor der Kuh platziert wurde. Die Kolostrum-Menge wurde in Kilogramm erfasst und die Kolostrum-Qualität wurde mittels Brix-Refraktometrie und ELISA bestimmt. Zur Auswertung der Daten wurde mit SPSS (SPSS Inc., IBM, Ehningen, Deutschland) ein generalisiertes lineares gemischtes Modell (GENLINMIXED) erstellt. Die mittlere Kolostrum-Menge betrug 4,17 ± 0,30 kg (Mittelwert ± Standardfehler). Die Behandlungsverfahren und die Zeit des ersten Melkens nach dem Kalben hatten keinen Einfluss auf die Kolostrum-Menge, aber die Laktationsanzahl, das Geburtsgewicht des Kalbes und die Kalbezeit hatten einen Einfluss auf die Kolostrum-Menge. Die geringste Menge hatten Kühe in zweiter Laktation (3,74 ± 0,37 kg). Während Erstkalbinnen (4,75 ± 0,34 kg) und Kühe in Laktation 3 oder höher (4,75 ± 0,38 kg) höhere Kolostrum-Mengen aufwiesen. Weiterhin hatten Kühe, die nachts kalbten (22:00 bis 06:00 Uhr; 4,93 ± 0,37 kg), die höchste Kolostrum-Menge. Kühe, die morgens (06:00 bis 14:00 Uhr; 4,17 ± 0,38 kg) oder nachmittags (14:00 bis 22:00 Uhr; 4,14 ± 0,34 kg) kalbten, hatten eine geringere Kolostrum-Menge. Achtundvierzig Prozent der mit ELISA untersuchten Kolostrumproben enthielten ≥ 50 mg IgG/mL (54,6 ± 2,80 mg IgG/mL). Die Qualität des Kolostrums wurde durch die Behandlungsverfahren sowie durch die Kolostrum-Menge, die Laktationsanzahl, die Kalbezeit, die Zeit des ersten Melkens nach dem Kalben und den Wochentag, an dem die Abkalbung stattfand, beeinflusst. Die Behandlungsverfahren führten zu durchschnittlich höheren IgG-Konzentrationen im Kolostrum (OXY: 57,0 mg IgG/mL; CA: 56,0 mg IgG/mL) im Vergleich zur Kontrollgruppe (50,7 mg IgG/mL). Eine hohe Kolostrum-Menge und eine längere Zeitverzögerung zwischen Kalben und Melken verminderten die Kolostrum-Qualität. Kühe in Laktation 3 oder höher (64,6 ± 2,59 mg IgG/mL) hatten eine höhere IgG-Konzentration als Erstkalbinnen (48,5 ± 2,86 mg IgG/mL) und Kühe in Laktation 2 (50,7 ± 2,89 mg IgG/mL). Das Kalben in der Nacht führte zu höheren IgG-Konzentrationen (60,4 ± 2,92 mg IgG/mL) im Vergleich zum Kalben am Morgen oder Nachmittag (51,9 ± 2,98 und 51,3 ± 2,71 mg IgG/mL). Das Kalben an Sonntagen erhöhte die Kolostrum-Qualität (61,4 ± 3,70 mg IgG/mL). Die Behandlungsverfahren und die Zeit des ersten Melkens nach dem Kalben hatten keinen Einfluss auf die Kolostrum-Qualität, die durch Brix-Refraktometrie beurteilt wurde. Dennoch wurde wie bei der ELISA-Untersuchung ein negativer Zusammenhang zwischen Kolostrum-Menge und Qualität festgestellt. Kühe in Laktation 3 oder höher zeigten höhere Brixwerte (27,7 ± 0,26 % Brix) im Vergleich zu Erstkalbinnen (25,3 ± 0,30 % Brix) und Kühen in Laktation 2 (25,0 ± 0,32 % Brix). Das Ziel der dritten Studie war es, verschiedene Analysemethoden (d.h. ELISA, Kapillarelektrophorese [CE], Refraktometrie) und drei verschiedene Medien (d.h. zentrifugiertes Serum, zentrifugiertes Plasma, gefiltertes Plasma) zur Beurteilung von FPT bei neugeborenen Kälbern zu evaluieren. Als Goldstandard wurde die radiale Immundiffusion (RID) gewählt und FPT wurde, wie schon erwähnt, mit IgG-Konzentrationen < 10 mg/mL im Serum definiert. Blutproben wurden von Kälbern der Rasse Holstein Friesian (n = 216) im Alter von ein bis sieben Lebenstagen aus zwei kommerziellen Milchviehbetrieben in Nordostdeutschland entnommen. Das Serum wurde durch Zentrifugation gewonnen und die Plasmaextraktion wurde, wie bereits in der ersten Studie, entweder durch ein Filtersystem oder durch Zentrifugation durchgeführt. Für die Plasmafiltration wurde ein Einweg-Plasmafilter verwendet (2-Drop-Filter, Pharmadoc, Lübeck, Deutschland). Die Labormethoden, RID, ELISA und CE, bestimmten die IgG-Konzentration in den Serumproben. Für die Refraktometrie wurden zwei Refraktometer verwendet, ein optisches Refraktometer (RF.5612 Handrefraktometer, Euromex Holland, Arnheim, Niederlande) zur Beurteilung der TP-Konzentration in allen drei Medien und ein digitales Brix-Refraktometer (Misco PA201, Misco, Solon, OH) zur Beurteilung der TS. Die RID-Analyse ergab eine FPT-Prävalenz von 27 % (59/216). Der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen RID und CE lag bei r = 0,97 im Serum; zwischen RID und ELISA lag er bei r = 0,90. Darüber hinaus konnte eine hohe Korrelation zwischen CE und ELISA festgestellt werden (r = 0,89). Die Ergebnisse der Refraktometrie korrelierten hochgradig mit den RID-Ergebnissen im zentrifugierten Serum, zentrifugierten Plasma und gefilterten Plasma (Brix-Refraktometer: r = 0,84; r = 0,80; r = 0,78; optisches Refraktometer: r = 0,83; r = 0,81; r = 0,80). Die Testeigenschaften (optimale Grenzwerte, Se, Sp, positiver prädiktiver Wert [PPV], negativer prädiktiver Wert [NPV] und AUC) zur Beurteilung von Kälbern mit FPT für alle Verfahren und alle drei verschiedenen Medien wurden durch ROC-Kurven Analyse unter Verwendung des RID als Referenzwert bestimmt. Zusammenfassend sind alle vier verschiedenen Analysemethoden zur Beurteilung von FPT (ELISA, CE und zwei Methoden der Refraktometrie) geeignet. Die Testgenauigkeit innerhalb der direkten Labormethoden und innerhalb der indirekten On-Farm-Geräte war sehr gut, da sich die 95 % CI für AUC überlappten, unabhängig von den drei verschiedenen Medien (zentrifugiertes Serum und Plasma sowie gefiltertes Plasma). Allerdings müssen für jede Analysemethode unterschiedliche Grenzwerte berücksichtigt werden, insbesondere, wenn unterschiedliche Medien verwendet werden. Die Ergebnisse zeigten erneut, wie in der ersten Studie, dass die optimalen Grenzwerte für Plasma im Vergleich zu Serum höher lagen. Folglich können alle Methoden zur Beurteilung von FPT genutzt sowie Serum- und Plasmaproben eingesetzt werden, wenn man die unterschiedlichen Grenzwerte berücksichtigt. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass (1) ein Einweg-Plasma-Filtersystem als Point-of-Care-System für die FPT-Analyse geeignet ist, aber weitere Forschungsarbeit erforderlich ist, (2) exogenes Oxytocin und das Vorhandensein des Kalbes die IgG-Konzentration im Kolostrum beim ersten Melken verbessern, aber keinen Einfluss auf die Kolostrum-Menge haben, und (3) verschiedene Analysemethoden zur Beurteilung von FPT geeignet sind, wenn unterschiedliche Grenzwerte berücksichtigt werden. Diese Ergebnisse haben das Potenzial, das Kolostrum-Management und die Gesundheit der Kälber in Milchviehbetrieben zu verbessern.