Die Rolle von ATP-sensitiven Kaliumkanälen in der Regulation des oxidativen Stoffwechsels und der zirkulativen Aktivität beim Rind | Role of ATP- sensitive potassium channels in the regulation of oxidative metabolism and circulative activity in cattle

Deckblatt, Ablürzungsverzeichnis, Tabellen- u. Abbildungsverzeichnis, Inhaltsverzeichnis, Danksagung 1. Einleitung 9 2. Literatur 11 3. Zielstellung der Arbeit 34 4. Methoden 35 5. Versuchsauswertung und Statistik 48 6. Ergebnisse 49 7. Diskussion 74 8. Zusammenfassung und Schlussfolgerungen 80 9. Summary 84 10. Literatur 86

1\. Untersuchungsziel Ziel der Untersuchungen war, die Rolle von KATP-Kanälen für den bekannten Zusammenhang zwischen der oxidativen Stoffwechselintensität und der zirkulativen Aktivität beim Rind zu untersuchen. 2\. Methoden Zur Induktion differenter Stoffwechselintensitäten wurden 8 Jungbullen im Alter von 300±10 Tagen und einer Lebendmasse von 295±15kg in zwei Diätgruppen mit jeweils 4 Tieren zufallsmäßig aufgeteilt. Die Gruppen erhielten Futter mit einer umsetzbaren Energie 1,5- und 2,0-fach des Erhaltungsbedarfs (1,5-MEm- und 2,0-MEm-Gruppen). Dies entspricht einer mäßig restriktiven und ad libitum Versorgung mit umsetzbarer Energie. Die Stoffwechselintensität wurde über den Gasaustausch in Respirationskammern gemessen. Die zirkulative Aktivität wurde durch die Herzfrequenz und über den Blutfluss der Saphenavene erfasst. KATP- Kanäle wurden auf zellulärer, molekularer und pharmakologischer Ebene analysiert. Auf der Zellebene wurden Sulfonylharnstoffrezeptoren (SUR) unter Verwendung eines fluoreszenten Glibenclamidderivates und der Flusszytometrie in Herzmyozyten, Saphenamyozyten und zirkulierenden Monozyten untersucht. Auf molekularer Ebene wurden Transkripte, die KATP-Proteine kodieren (SUR2, Kir6.1, Kir6.2), in Gesamt-RNA aus dem rechten Ventrikel über eine RT-PCR unter Verwendung spezifischer Primer bestimmt. Die pharmakologische Herangehensweise bestand darin, dass die Reaktion der Herzfrequenz und des Saphenablutflusses auf eine Infusion mit Levcromakalim (80 und 240 nMol/kg), einem KATP-Kanal-Aktivator, und die Spezifität dieser Reaktion durch Vorbehandlung mit Glibenclamid (480 nMol/kg), einem KATP-Kanal-Inhibitor, geprüft wurde. Die Transkriptions- und Blutflussdaten wurden an 3 Tieren je Gruppe erhoben, weil ein Tier ein unnormales Futteraufnahmeverhalten entwickelte und die anatomische Position der Saphenavene bei einem anderen Versuchstier von der normalen abwich, so dass die Messergebnisse unsicher waren. 3\. Ergebnisse - Diäten mit 1,5-MEm und 2,0-MEm erzeugten eine signifikant unterschiedliche basale Wärmeproduktion(601±34 und 656±15 kJ/kg0,75d), basale Herzfreqenz (60±5 und 71±8 Schläge/min) und basale Saphenablutflussintensität (35±10 und 6±2 ml/min). - Während das Ventrikelmyocardium der 1,5-MEm-Gruppe sowohl SUR2A- als auch SUR2B-Transkripte aufwies, waren im Gewebe der 2,0-MEm-Gruppe fast ausschließlich SUR2B-Transkripte nachweisbar. Kir6.1- und Kir6.2-Transkripte wurden in beiden Gruppen nachgewiesen (wahrscheinlich mit deutlichen individuellen Unterschieden in ihrer Häufigkeit relativ zur Konzentration von ß-Actin-mRNA). - Die Glibenclamidanalysen wiesen unterschiedliche Affinitäten, gemessen über die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, KD, zwischen den Diätgruppen bei Monozyten (1,5-MEm, KD = 25±3,5nM; 2.0-MEm, KD = 35±4nM) und Herzmyozyten (1,5-MEm, KD = 23±2nM; 2,0-MEm, KD = 28±4nM) nach. Die KD-Werte der Saphenamyozyten der Diätgruppen unterschieden sich nicht. - Levcromakalim induzierte zeitabhängige, von der Futteraufnahme und der Diät abhängige Reaktionen. Die futteraufnahmeinduzierte Herzfrequenz reagierte in der 1,5-MEm-Gruppe nicht auf Levcromakalim in der Zeitspanne bis 1h nach der Infusion, war aber signifikant geringer (P<0,05) in der Zeitspanne 400-500 min nach der Infusion. Die Herzfrequenz in der 2,0-MEm-Gruppe reagierte umgekehrt. Diese Reaktionen wurden durch Glibenclamid entweder reduziert oder aufgehoben. - Eine Aktivierung des KATP-Kanals durch Levcromakalim hob in der 2,0-MEm-Gruppe den futteraufnahmeinduzierten Anstieg im Saphenablutfluss auf. Dagegen erhöhte Levcromakalim den Anstieg im Saphenablutfluss der 1,5-MEm-Gruppe entweder in der individuell unterschiedlichen Reaktion auf die Futteraufnahme am Morgen oder am Nachmittag. 4\. Schlussfolgerungen - Die Häufigkeit von Sulfonylharnstoffrezeptoren, die in den Typen 2A und 2B im Rinderherz vorkommen, ist ernährungsseitig beeinflussbar. - Eine intensivere Aufnahme von umsetzbarer Energie führt zu einer Verschiebung des Expressionsmusters von SUR2A und SUR2B zu SUR2B. - KATP-Kanäle im Herzmuskel sind an der Regulation der Herzfrequenz von Rindern beteiligt. - KATP-Kanäle mit Sulfonylharnstoffrezeptoren vom 2B-Typ gehen mit einer höheren Herzfrequenz einher. - Die Regulation des Saphenablutlusses verläuft wahrscheinlich nur in einer untergeordneten Weise über KATP-Kanäle in Saphenazellen. Vielmehr scheinen KATP-Kanäle eine Rolle auf den Ebenen Zentralnervensystem-Herz zu spielen, die den Saphenablutfluss in übergeordneter Weise regulieren. - Der Übergang von einer SUR2A/SUR2B zu einer SUR2B-Expression kann als eine adaptive Reaktion auf eine überschüssige umsetzbare Energieaufnahme aufgefasst werden, denn die SUR2B-KATP-Kanäle sind der Aktivierung durch NDP bei hohem intrazellulären ATP-Spiegel leichter zugänglich. - Der Kaliumausstrom in den extrazellulären myocardialen Raum kann einen Anstieg in der Kontraktionshäufigkeit auslösen. Geöffnete KATP-Kanäle verbrauchen infolge einer ATPase-Aktivität ihrer Sulfonylharnstoffrezeptoren Energie, ebenfalls die intensivere Herzarbeit. Die Änderung vom geschlossenen in den den offenen Kanalzustand verbraucht aber nur geringe Mengen Energie, wobei mehr Energie bei der Wiederherstellung des Na/ K- Gradienten durch die Na/ K- ATPase verbraucht wird. Das trägt zur Verringerung überschüssiger Energie bei einer Aufnahme von umsetzbarer Energie ad libitum bei und zur Umverteilung des Blutes in Richtung der Verdauungsorgane. - Dieser plausibel erscheinende Adaptationsvorgang erfordert eine weitergehende Beweisführung, insbesondere hinsichtlich der KATP-Kanalformen in Gehirnzentren, die in die Regulation der Herzaktivität einbezogen sind. Von besonderem Interesse für die Gesundheit von Mensch und Tier ist dabei die Klärung der Frage, ob die vermutete Adaptation an überschüssige, mit der Nahrung aufgenommene umsetzbare Energie mit der Entwicklung von Arrhythmien verbunden ist.

Role of ATP- sensitive potassium channels in the regulation of oxidative metabolism and circulative activity in cattle Background High intake of metabolizable energy poses risk to metabolic disorders. KATP channels are therapeutic targets but their pharmacological sensitivity changes with altered subunit composition. In addition, sensitivity changes in cardiovascular diseases associated with metabolic disorders occurring in high intake of metabolizable energy. This suggests the possibility that subunit composition is a dietary target. The aim of the study was to examine this hypothesis. Methods and Results \- Young bulls (300±10 days old and 295±15 kg in weight) were fed 1.5- and 2.0-fold metabolizable energy for maintenance (MEm), four in each group. This feeding schedule corresponded to moderately restricted and ad libitum metabolizable energy intake and induced significant (P<0.05) different metabolic rates at rest (601 and 656 kJ/kg0.75d) measured by indirect calorimetry. Higher resting metabolic rate corresponded to an elevated heart rate at rest (60±5 versus 71±8 beats/min in the 1.5- and 2.0-MEm groups, P<0.05). The animals were treated with levcromakalim (80 nmol/kg), an opener of KATP channels (KCO), using a dose of 80 nmol/kg and levcromakalim post-glibenclamide (480 nmol/kg), an inhibitor of KATP channels (KCJ). Oppositely to the 1.5-MEm group, meal-evoked heart rate was reduced in the 60 min period but substantially increased in the 400-500 min period post- KCO, responses abolished by KCJ pre-treatment, indicative for specific results mediated by KATP channels. KCO inhibited a meal-induced saphenous vein flow in the 2.0-MEm group measuring the flow by an electromagnetic probe. In contrast the 1.5-MEm group responded to a treatment with KCO with a meal-induced flow higher than the control (administration of the solvent). The density and the affinity to glibenclamide of sulfonylurea receptors was analyzed using a fluorescent derivative of glibenclamide, glibenclamide Bodipy, in ventricular and saphenous vein myocytes and cytoflowmetric detection of the fluorescence intensity/single cell. The equilibrium dissociation constant of ventricular myocytes from the 1.5-MEm group differed significantly from the constant of ventricular myocytes from the 2.0-MEm group in contrast to saphenous vein myocytes, suggesting diet induced changes in glibenclamide binding properties occurred at the cardiac level. An analysis of ventricular transcripts by reverse transcription \- DNA polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed by specific primers for mRNA encoding SUR2, Kir6.1 and Kir6.2 proteins. Electrophoretic separation revealed a shift from SUR2A to SUR2B transcripts comparing the RT-PCR products of the 1.5-MEm with the 2.0-MEm groups. Thus, predominant expression of SUR2B was accompanied with elevated heart rate and metabolic rate. Conclusions - KATP channel constituents are diet-responsive, thereby high intake of metabolizable energy can alter channel composition. This change may have physiological consequences indicated by glibenclamide binding in vitro and by the responses of the heart rate and venous flow to the KATP opener, levcromakalim, since they were reduced or abolished by glibenclamide. As heart rate and metabolic rate are correlated, the results strongly suggest involvement of KATP channels in the metabolic regulation of whole animals and changes in KATP channel composition contribute to changes in their function.