Viral pathogens in water: occurrence, fate and environmental circulation - Patógenos virales en el agua: presencia, estabilidad y circulación ambiental

Water is an essential resource for life, playing a crucial role in various human activities such as domestic use, agriculture, and industry. However, its capacity to transport physical, chemical, and biological contaminants, including viruses, poses significant public health risks. This thesis evaluates the presence of viral pathogens in different types of water and their stability in environmental waters. Waterborne pathogens can spread through contaminated water, impacting the water cycle and entering the food chain. Nevertheless, the contaminants in wastewater offer valuable insights through wastewater-based epidemiology (WBE), which can estimate the circulation of pathogens within populations. This approach enables rapid, cost-effective, and non-invasive assessments, complementing conventional epidemiology. In the context of WBE applied to virus surveillance, effective concentration methods are essential for virus detection and sequencing, driving the need for new approaches to enhance these analyses. Furthermore, wastewater reuse, a sustainable solution to water scarcity, demands rigorous controls to prevent the spread of pathogens and contaminants. The presence of human enteric viruses, along with respiratory and emerging viruses, at various points in the water cycle underscores the importance of studying their stability and viability in different water matrices. In this thesis, epidemiological studies, virus stability analyses, and methodological comparisons have been conducted to address the issues arising from the presence of pathogenic viruses throughout the water cycle. The results from a year-long epidemiological study for multi-pathogen surveillance (including human enteric viruses, SARS-CoV-2, influenza A virus, and respiratory syncytial virus) in wastewater revealed high levels of the analysed viruses. This demonstrated the effectiveness of molecular methods, such as RT-qPCR and massive sequencing, in studying the prevalence and dynamics of viral variants. Furthermore, respiratory viruses showed a positive correlation with reported clinical data when using physicochemical parameters to normalize data, and predictive models confirmed WBE as an early-warning and monitoring system. Additionally, these techniques, routinely applied for SARS-CoV-2 analysis at the national level, proved to be powerful tools for health crisis responses, enabling the detection of emergent viruses like the monkeypox in sewage during the outbreak in Spain in 2022. These methods were further improved in a comparative study that evaluated two concentration methods, showing that newly developed methods focused on viral nucleic acid capture enhanced the sensitivity of molecular methods to detect enteric, respiratory, and indicator viruses. These new methods were applied to analyse the presence of pathogenic viruses throughout the urban water cycle, in six wastewater treatment plants over the course of one year, demonstrating the presence of these viruses in reclaimed water and biosolids. This highlighted the low efficiency of the analysed wastewater treatment plants in removing pathogenic viruses and the bioaccumulation of these pathogens in biosolids. The evaluation of viral stability in water microcosms at different temperatures showed that viruses could persist in infectious forms depending on the virus type and water conditions. Moreover, results using viability PCR indicated that it is not appropriate for monitoring virus infectivity decay in waters. In conclusion, the presence of viruses in water and their potential to cause diseases underscore the importance of developing effective detection and treatment strategies. Enhancing water and biosolid treatment technologies is crucial to mitigate the risks associated with water reuse in agriculture and other applications.

El agua es un recurso esencial para la vida y desempeña un papel crucial en diversas actividades humanas como el uso doméstico, la agricultura y la industria. Sin embargo, su capacidad para transportar contaminantes físicos, químicos y biológicos, incluidos virus, plantea importantes riesgos para la salud pública. Esta tesis evalúa la presencia de patógenos virales en diferentes tipos de agua y su estabilidad en aguas ambientales. Los patógenos transmitidos por el agua pueden propagarse a través del agua contaminada, afectando el ciclo del agua, pudiendo incorporarse a la cadena alimentaria. No obstante, los contaminantes de las aguas residuales ofrecen información valiosa a través de la epidemiología basada en aguas residuales (WBE), que puede estimar la circulación de patógenos dentro de las poblaciones. Este enfoque permite evaluaciones rápidas, rentables y no invasivas, que complementan la epidemiología convencional. En el contexto de la WBE aplicada a la vigilancia de virus, el uso de métodos eficaces de concentración es fundamental para la detección y secuenciación de virus, lo que conlleva la necesidad de desarrollar nuevos enfoques para mejorar estos análisis. Además, la reutilización de aguas residuales, una solución sostenible para mitigar la escasez hídrica, requiere controles rigurosos para prevenir la propagación de patógenos y contaminantes. La presencia de virus entéricos humanos, así como de virus respiratorios y emergentes, en varios puntos del ciclo del agua, subraya la importancia de estudiar su estabilidad y viabilidad en diferentes matrices de agua. En esta tesis se han llevado a cabo estudios epidemiológicos, investigaciones sobre la estabilidad de virus y comparaciones metodológicas para abordar los problemas derivados de la presencia de virus patógenos a lo largo del ciclo urbano del agua. Los resultados de un estudio epidemiológico realizado durante un año para la vigilancia de múltiples patógenos (incluyendo virus entéricos humanos, SARS-CoV-2, virus de la influenza A y virus respiratorio sincitial) en aguas residuales revelaron niveles elevados de los virus analizados. Esto demostró la eficacia de los métodos moleculares, como la RT-qPCR y la secuenciación masiva, para estudiar la prevalencia y la dinámica de las variantes virales. Además, los virus respiratorios mostraron una correlación positiva con los datos clínicos cuando se utilizaron parámetros fisicoquímicos para normalizar los datos, y los modelos predictivos confirmaron que la WBE es un sistema de alerta temprana y monitoreo. Además, esta aproximación, aplicada de forma rutinaria en el análisis del SARS-CoV-2 a nivel nacional, demostró ser una herramienta muy útil para dar una respuesta rápida a situaciones de riesgo para la salud, permitiendo la detección del virus de la viruela del mono en aguas residuales durante el brote en España en 2022. En el marco de esta tesis, se mejoraron metodologías mediante estudios comparativos donde se evaluaron dos métodos de concentración, mostrando que los métodos recientemente desarrollados, centrados en la captura de ácido nucleico viral, mejoran la sensibilidad de los métodos moleculares para detectar virus entéricos, respiratorios e indicadores. Estos nuevos métodos se aplicaron para analizar la presencia de virus patógenos a lo largo del ciclo urbano del agua, en seis plantas de tratamiento de aguas residuales durante un año, demostrando la presencia de estos virus en el agua regenerada y los biosólidos. Esto destacó la baja eficiencia de las plantas de tratamiento de aguas residuales analizadas con relación a la eliminación de virus patógenos y la bioacumulación de estos en biosólidos. La evaluación de la estabilidad viral en microcosmos acuáticos a diferentes temperaturas mostró que los virus podrían persistir en formas infecciosas dependiendo del tipo de virus y las condiciones del agua. Además, los resultados de la PCR de viabilidad indicaron que esta técnica no es apropiada para monitorizar la caída de la infectividad del virus en las aguas. En conclusión, la presencia de virus en el agua y su potencial para causar enfermedades subraya la importancia de desarrollar estrategias efectivas de detección y tratamiento. Mejorar las tecnologías de tratamiento de agua y biosólidos es crucial para mitigar los riesgos asociados con la reutilización del agua en la agricultura y otras aplicaciones.