Evolution and functional relevance of Ataxin-3 paralogues | Evolução e relevância funcional dos parálogos do gene Ataxin-3

Mestrado em Biomedicina Molecular

O gene ataxin-3 (ATXN3; 14q32.1) codifica uma proteína expressa ubiquamente, envolvida na via ubiquitina-proteassoma e na repressão da transcrição. Grande relevância tem sido dada ao gene ATXN3 após a identificação de uma expansão (CAG)n na sua região codificante, responsável pela ataxia mais comum em todo o mundo, SCA3 ou doença de Machado-Joseph (DMJ). A DMJ é uma doença neurodegenerativa, autossómica dominante, de início tardio. O tamanho do alelo expandido explica apenas uma parte do pleomorfismo da doença, evidenciando a importância do estudo de outros modificadores. Em doenças de poliglutaminas (poliQ), a toxicidade é causada por um ganho de função da proteína expandida; no entanto, a proteína normal parece ser, também, um dos agentes modificadores da patogénese. O gene ATXN3 possui dois parálogos humanos gerados por retrotransposição: ataxin-3 like (ATXN3L) no cromossoma X, e LOC100132280, ainda não caracterizado, no cromossoma 8. Estudos in vitro evidenciaram a capacidade da ATXN3L para clivar cadeias de ubiquitina, sendo o seu domínio proteolítico mais eficiente do que o domínio da ATXN3 parental. O objetivo deste estudo foi explorar a origem e a evolução das retrocópias ATXN3L e LOC100132280 (aqui denominadas ATXN3L1 e ATXN3L2), assim como testar a relevância funcional de ambas através de abordagens evolutivas e funcionais. Deste modo, para estudar a divergência evolutiva dos páralogos do gene ATXN3: 1) analisaram-se as suas filogenias e estimou-se a data de origem dos eventos de retrotransposição; 2) avaliaram-se as pressões seletivas a que têm sido sujeitos os três parálogos, ao longo da evolução dos primatas; e 3) explorou-se a evolução das repetições CAG, localizadas em três contextos genómicos diferentes, provavelmente sujeitos a diferentes pressões seletivas. Finalmente, para o retrogene que conserva uma open reading frame (ORF) intacta, ATXN3L1, analisou-se, in silico, a conservação dos locais e domínios proteicos da putativa proteína. Ademais, para este retrogene, foi estudado o padrão de expressão de mRNA, através da realização de PCR de Transcriptase Reversa, em 16 tecidos humanos. Os resultados obtidos sugerem que dois eventos independentes de retrotransposição estiveram na origem dos retrogenes ATXN3L1 e ATXN3L2, tendo o primeiro ocorrido há cerca de 63 milhões de anos (Ma) e o segundo após a divisão Platirrínios-Catarrínios, há cerca de 35 Ma. Adicionalmente, outras retrocópias foram encontradas em primatas e outros mamíferos, correspondendo, no entanto, a eventos mais recentes e independentes de retrotransposição. A abordagem evolutiva mostrou a existência de algumas constrições selectivas associadas à evolução do gene ATXN3L1, à semelhança do que acontece com ATXN3. Por outro lado, ATXN3L2 adquiriu codões stop prematuros que, muito provavelmente, o tornaram num pseudogene processado. Os resultados da análise de expressão mostraram que o gene ATXN3L1 é transcrito, pelo menos, em testículo humano; no entanto, a optimização final da amplificação específica dos transcriptos ATXN3L1 permitirá confirmar se a expressão se estende a outros tecidos. Relativamente ao mecanismo de mutação inerente à repetição CAG, os dois parálogos mostraram diferentes padrões de evolução: a retrocópia ATXN3L1 é altamente interrompida e pouco polimórfica, enquanto a ATXN3L2 apresenta tratos puros de (CAG)n em algumas espécies e tratos hexanucleotídicos de CGGCAG no homem e no chimpanzé. A recente aquisição da repetição CGGCAG pode ter resultado de uma mutação inicial de CAG para CGG, seguida de instabilidade que proporcionou a expansão dos hexanucleótidos.Estudos futuros poderão ser realizados no sentido de confirmar o padrão de expressão do gene ATXN3L1 e de detetar proteína endógena in vivo. Adicionalmente, a caracterização da proteina ataxina-3 like 1 e dos seus interatores moleculares poderá povidenciar informação acerca da sua relevância no estado normal e patológico.

Ataxin-3 gene (ATXN3; 14q32.1) encodes a ubiquitously expressed protein involved in the ubiquitin-proteasome pathway and in transcription repression. Much attention has been given to ATXN3 since the identification of an expanded (CAG)n tract in its coding region, responsible for the most common dominant ataxia worldwide, SCA3 or Machado-Joseph disease (MJD). MJD is an autosomal dominant, late-onset neurodegenerative disorder. The size of the expanded allele explains only part of the disease pleomorphism, highlighting the importance of studying other modifiers. In polyglutamine (polyQ) diseases, toxicity is caused by gain of function of the expanded protein; however, the normal protein appears to be one of the pathogenesis-modifying agents. The gene ataxin-3 has two human paralogues, generated by retrotransposition: ataxin-3 like (ATXN3L) on the X chromosome of humans and the yet uncharacterized LOC100132280 on chromosome 8. An in vitro study showed the ability of ATXN3L to cleave ubiquitin from their substrates, with its proteolytic domain even more efficient than the domain of the parental ATXN3. The aim of this study was to explore the origin and evolution of ATXN3L and LOC100132280 retrocopies (here named ATXN3L1 and ATXN3L2) and to test the functional relevance of both human paralogues through evolutionary and functional approaches. Thus, to study the evolutionary divergence of ATXN3 paralogues, we have 1) analysed their phylogeny and estimated the time of the retrotransposition events; 2) assessed the selective constraints that have been underlying all the three paralogues over primate evolution; and 3) explored the evolution of the (CAG)n tracts placed on three different chromosomal backgrounds within paralogue genes that have, probably, been under different selective pressures. Finally, for the retrogene that conserved the ORF, ATXN3L1, we analyzed the protein domain conservation and the mRNA expression pattern by performing Reverse Transcriptase-PCR in 16 human tissues. Our results suggested that two independent retrotransposition events have been on the origin of ATXN3L1 and ATXN3L2, the first occurred about 63 million years ago (MYA) and the second after the Platyrrhini-Catarrhini split, about 35 MYA. In addition, several other retrocopies have been found in primates and other mammals, but additional independent and younger retrotransposition events seemed to be on their origin. Our evolutionary studies suggested that ATXN3L1 has been under some selective constrains over primate evolution, as the parental ATXN3. ATXN3L2 gained premature stop codons that seem to have turned it into a pseudogene. In addition, we confirmed that ATXN3L1 is a transcriptionally-active retrogene since we observed mRNA expression, at least, in human testis. A refined optimization of the methodology to specifically amplify ATXN3L1 cDNA will be, however, necessary to assess the complete expression pattern of this retrogene. As for the (CAG)n tract, the ATXN3 paralogues presented different evolutionary patterns: ATXN3L1 showed a poorly polymorphic and highly interrupted tract across the primate lineage, whereas ATXN3L2 presented a pure (CAG)n in some species and a polymorphic hexanucleotide repeat in humans and chimpanzees. This recent acquisition of a repetitive CGGCAG resulted, probably, from a CAG to CGG mutation followed by instability that encompassed the six bases instead of the CAG alone. Future studies may be performed in order to confirm the expression pattern of ATXN3L1 and to detect the endogenous protein in vivo. Further characterization of ataxin-3 like 1 and its molecular interactors will give us insight into the actual relevance of this protein in normal and/or pathological states.