Development of regenerative medicine therapies based on Platelet-Derived Products for the treatment approaches of dogs and cats

Original thesis presented by Carla Sofia Alves Soares at the University of Trás-os-Montes e Alto Douro, to obtain the doctor’s degree on Veterinary Sciences

Platelet-derived products (PDPs) are hemoderivatives that have gained popularity, mainly due to their high concentrations of bioactive molecules such as growth factors (GFs) and cytokines (IL), which play important roles in tissue healing and regeneration. Their therapeutic effect has been widely recognized in human medicine. The rationale for the use of platelet-based products stems from the fact that platelets, after being activated, release their associated structural proteins and others, that modulate inflammation and tissue repair. PDPs embraced in this thesis are envisioned as biodegradable, economic, safe, fast, and easily obtained in the clinics, for both tissue engineering and regenerative therapy strategies. In veterinary medicine, however, the lack of standard protocols to generate PDPs is a major hurdle for assessing the clinical relevance of PDP-based therapies, and their widespread usage. The most cited hemoderivatives applied in human and veterinary settings can be roughly classified into platelet-poor and platelet-rich products. They are distinguished mainly by the presence of platelets, not devaluing, however, their composition in leukocytes. The most cited and studied PDPs are i) the platelet concentrate (PC), which is sometimes referred to as platelet-rich plasma (PRP); ii) platelet-poor plasma (PPP); and iii) platelet-rich fibrin (PRF). All these fractions can be obtained from a simple blood collection. This thesis investigates specific hemoderivatives with therapeutic interest, in a real clinical veterinary context: the canine-sourced PRFs (as an active biomaterial for wound regeneration), and both canine and feline PCs (for other clinical treatment methodologies, in dogs and cats). Chapter I scrutinizes the technical and scientific specificities of PDPs in terms of preparation methodologies, classification categorization, nomenclature, and biological properties to advance their future biotechnological potential in veterinary contexts. Furthermore, this chapter also summarises the clinical cases reported in veterinary medicine using the PRDs, claiming the use of well-characterized platelet-based formulation in both laboratory and clinical veterinary contexts. Chapter II summarises the research objectives of this project. Chapter III aimed to characterize both canine and feline-origin PRFs. Moreover, a standardized protocol was obtained using low blood volume, and the structural and biochemical characterization of PRFs from dogs and cats was demonstrated. According to the authors' knowledge, this is the first work characterizing canine and feline PRFs in terms of secretome protein pattern and structure. Chapters IV, V, VI, and VII address the clinical efficacy of PRF-therapy as an innovative grafting technique for wound regeneration in dogs and cats, as an autologous, allogeneic, or xenogeneic methodology. This section represents clinical research in real patients (domestic dogs and cats), demonstrating the clinical performance of PRF-therapy in the treatment of naturally occurring skin wounds. PRF-therapy was considered an effective and safe biological regenerative therapy for wound regeneration, revealing a natural antimicrobial effect. Chapter VIII focuses on the production of canine PCs within the clinic, reporting a considerable donor variability associated with their manufacture, using the double centrifugation technique. This research feature has not been described in the literature on canine species. Additionally, Chapter IX describes the optimization of a standard protocol for feline-sourced PC manufacture, using a double centrifugation technique, also reproducible in the clinics, avoiding the use of commercial kits. Furthermore, the proposed protocol used low-volume blood samples, revealing a highly efficient protocol. Lastly, Chapter X comprises the General Discussion, and Chapter XI is the main Concluding Remarks of the work developed under the scope of this thesis.

Os produtos derivados de plaquetas (PDPs) são hemoderivados que ganharam recentemente popularidade, principalmente devido às suas altas concentrações de moléculas bioativas, como fatores de crescimento (GFs) e citocinas (IL), que desempenham papéis importantes na cicatrização e regeneração dos tecidos biológicos lesados. O seu efeito terapêutico tem sido amplamente reconhecido na medicina humana. A justificação para o uso de produtos ricos em plaquetas (platelet-based products) deve-se ao facto de que as plaquetas, após serem ativadas, libertam proteínas estruturais que modulam a inflamação e a regeneração dos tecidos lesados. Os PDPs abrangidos nesta tese são considerados biodegradáveis, de obtenção rápida e económica, seguros, sendo obtidos com relativa facilidade em meio clínico. Os PDPs podem ser usados enquanto estratégias de engenharia de tecidos, ou como produto clínico a ser integrado em terapias regenerativas. Na medicina veterinária, no entanto, a falta de protocolos padronizados para produzir PDPs constitui um grande obstáculo para a correta avaliação da sua eficácia clínica, enquanto terapia plaquetária. Os hemoderivados mais citados na literatura aplicados em contexto clínico humano e veterinário podem ser classificados, de forma generalizada como: produtos pobres em plaquetas e produtos ricos em plaquetas. Distinguem-se principalmente pela presença de plaquetas, não desvalorizando, porém, sua composição em leucócitos. Os PDPs mais estudados são: i) o concentrado de plaquetas (PC), algumas vezes chamado de plasma rico em plaquetas (PRP); ii) plasma pobre em plaquetas (PPP); e iii) fibrina rica em plaquetas (PRF). Todas essas frações podem ser obtidas a partir de uma simples colheita de sangue. Esta tese investiga os hemoderivados com interesse terapêutico regenerativo, num contexto clínico veterinário real: os PRFs de origem canina (como um biomaterial ativo para regeneração de feridas), e PCs de origem canina e felina (para outras metodologias de tratamento clínico, em cães e gatos). O Capítulo I examina as especificidades técnicas e científicas dos PDPs, em termos de metodologias de preparação, categorização de classificação, nomenclatura e propriedades biológicas, para compreender o seu potencial biotecnológico futuro, em contexto médicoveterinário. Além disso, este capítulo também resume casos clínicos relatados em medicina veterinária usando os PRPs, reivindicando o uso de formulação à base de plaquetas bem caracterizados, em contexto laboratorial e clínico. O Capítulo II sintetiza os objetivos da pesquisa associados a este projeto O Capítulo III teve como objetivo caracterizar os PRFs de origem canina e felina. Além disso, foi obtido um protocolo padronizado, com recurso a um baixo volume de sangue do dador, e foi demonstrada a caracterização estrutural e bioquímica dos PRFs, de cães e gatos. De acordo com o conhecimento dos autores, até à data, este é o primeiro trabalho com a caracterização de PRFs de origem canina e felina em termos de composição do secretoma dos PRFs estudados. Os Capítulos IV, V, VI e VII abordam a eficácia clínica da terapia com PRF, enquanto técnica de enxerto inovadora para a regeneração de feridas em cães e gatos, na vertente autóloga, alogénica ou xenogénica. Esta seção foca a eficácia terapêutica dos PRFs de origem canina em pacientes reais (cães e gatos domésticos), demonstrando o desempenho clínico da terapia PRF no tratamento de feridas cutâneas de ocorrência natural. A conclusão dos trabalhos clínicos valida a terapêutica PRF enquanto uma opção clínica regenerativa e biológica, eficaz e segura para a regeneração de feridas, sugerindo um efeito antimicrobiano inato. O Capítulo VIII centra-se na produção de PCs caninos na clínica utilizando a técnica de dupla centrifugação, relatando uma considerável variabilidade na concentração final de plaquetas nos PCs produzidos, atribuída ao dador. Esta linha de pesquisa não foi, até ao momento, descrita na literatura (espécie canina). Adicionalmente, o Capítulo IX descreve a otimização de um protocolo padronizado para a preparação de PCs de origem felina, utilizando uma técnica de dupla centrifugação, também reprodutível na clínica, evitando o uso de kits comerciais. Além disso, o protocolo proposto utilizou amostras de sangue de baixo volume. Na conclusão deste trabalho, obteve-se um protocolo altamente eficiente para produzir PCs felinos, com vista à sua utilização em terapêuticas clínicas regenerativas. Por fim, o Capítulo X compreende a Discussão Geral, e o Capítulo XI as Considerações Finais, relativas ao trabalho desenvolvido no âmbito desta tese.

This work is supported by Portuguese Government Founds and through the European Social Fund (ESF), through FCT - Portuguese Foundation for Science and Technology, under the scholarship SFRH/BD/118871/2016