Phenolic composition and antioxidant activity of Punica granatum L. (pomegranate) leaf for medicinal infusion with potential health benefits

Esta Tese foi expressamente elaborada para cumprimentos dos requisitos necessários à candidatura ao grau de Doutor em Cadeias de Produção Agrícola - da mesa ao campo pela Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

A exploração de subprodutos naturais e o desenvolvimento de aplicações terapêuticas a partir de recursos vegetais existentes atraiu gradualmente a atenção mundial por consideráveis benefícios saudáveis, económicos e ambientais. Punica granatum L., comumente conhecida como romã pertencente à família Punicaceae, tornou-se uma cultura medicinal e frutífera essencial, amplamente consumida em todo o mundo. Não só o consumo de sumo de romã, mas também o uso das suas partes anatómicas não comestíveis tem uma longa história etnomédica e aceita inúmeros estudos pré-clínicos e/ou clínicos atualmente. Dentre elas, as folhas de romã (PGL), como resíduos agrícolas e industriais, têm ganhado cada vez mais interesse científico recentemente, sendo um reservatório de nutrientes benéficos e fitoquímicos bioativos, particularmente pela sua composição (poli)fenólica complexa e interação sinérgica, incluindo ácido elágico, elagitaninos, flavonóides, ácidos fenólicos, entre outros, e pelas propriedades biológicas que esta matriz apresenta, nomeadamente atividade hiperglicémica, antimicrobiana, anticancerígena e antiparasitária, bem como impactos protetores no cérebro, pulmão, fígado e rins. No entanto, o grau dessas atividades depende da diversidade estrutural dos constituintes polifenólicos que possuem alta bioatividade devido ao número e localização dos grupos hidroxilo e galoil, podendo causar degradação, oxidação, epimerização e polimerização de compostos ativos durante o processamento de alimentos. Da informação obtida na literatura, sabe-se que existem poucas pesquisas sobre a capacidade antioxidante de PGL em comparação com outras plantas medicinais e alimentares de renome. A literatura atual possui igualmente poucas informações sobre a estabilidade dos extratos de PGL. Mais perfis biológicos e farmacológicos de PGL precisam de ser explorados e ilustrados por ensaios pré-clínicos e clínicos. Além disso, a superioridade do PGL ainda não foi enfatizada e revisada completamente, embora muitos investigadores tenham destacado a importância da romã. Assim, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar os compostos fenólicos e propriedades antioxidantes de folhas colhidas de sete plantas medicinais e alimentares, incluindo sálvia, alecrim, arruda, hortelã-pimenta, salsa, azeitona e romã, todas cultivadas no norte de Portugal. A variação da composição polifenólica e capacidade antioxidante de infusões de PGL recém-preparadas foi avaliada durante um dia de armazenamento à temperatura ambiente para demonstrar a alta estabilidade da infusão. Além disso, as propriedades antineoplásicas e quimio- terapêuticas, bem como as propriedades toxicológicas da infusão de PGL foram realizadas em camundongos transgénicos portadores de oncogenes do papilomavírus humano (HPV) tipo 16 para expandir a futura aplicação farmacológica de PGL. Para isso, as folhas das sete plantas acima referidas foram colhidas em plena floração para obter o maior teor de compostos fenólicos. O conteúdo fenólico total (TPC), os orto-difenóis (TOC), o conteúdo total de flavonoides (TFC) e o conteúdo total de taninos (TTC), bem como as capacidades antioxidantes (AOC) medidas pelo catião radical diamónio (ABTS) e o ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e a abordagem do poder antioxidante redutor férrico (FRAP) foram realizados com base nos princípios espectrofotométricos e colorimétricos. Os perfis fenólicos foram identificados pelos padrões autênticos recorrendo à análise de Fase Reversa - Cromatográfica Líquida de Alto Desempenho - Detector de Matriz de Diodos (RP-HPLC-DAD) e em comparação com a literatura pelo tempo de retenção, UV/Visível λmax e espetros. O coeficiente de correlação de Pearson (PCC) e a análise em componentes principais (PCA) foram realizados para correlacionar a composição fenólica e antioxidante e explicar as variáveis efetivas que afetam as semelhanças e diferenças da amostra. Além disso, camundongos transgênicos machos (portadores de HPV 16) com fundo FVB/n foram expostos a infusões de PGL de baixa (0,5%) e alta (1,0%) concentração durante 4 semanas consecutivas. O peso corporal dos animais, o consumo de bebidas e alimentos foram registados. Os órgãos internos, amostras de pele e sangue intracardíaco foram colhidos para avaliação de parâmetros toxicológicos, lesões neoplásicas e estresse oxidativo. Nos extratos hidrometanólicos das sete plantas medicinais e alimentares, os extratos de PGL apresentaram o maior TPC (199,26 mg de ácido gálico por grama de peso seco da planta), TOC (391,76 mg de ácido gálico por grama de peso seco da planta) e TTC (99,20 mg de epicatequina por grama de peso seco da planta), além do maior TFC (24 mg de catequina por grama de peso seco da planta). O maior AOC medido pelos métodos ABTS, DPPH e FRAP (2,14, 2,27 e 2,33 mmol Trolox por grama de peso seco da planta, respetivamente) também foi obtido em extratos de PGL, sendo 4-200 vezes maior que as outras espécies. Essa potente atividade antioxidante das amostras de PGL pode ser atribuída à presença de diferentes tipos de compostos fenólicos e ao alto teor de taninos, enquanto os ácidos fenólicos e flavonoides são as classes fenólicas dominantes das outras seis plantas. Consequentemente, apesar das propriedades antioxidantes bem conhecidas dessas espécies de plantas, este estudo sugere que a folha de romã pode-se destacar como uma fonte vegetal relativamente mais valiosa de moléculas bioativas naturais para o desenvolvimento de novos ingredientes alimentares e farmacêuticos funcionais com potencial, não apenas para promover a saúde humana, mas também melhorar a biovalorização e o meio ambiente. O estudo sobre a infusão de PGL revelou que não houve alterações significativas no TPC (131,40–133,47 mg de ácido gálico por grama) e TOC (239,91–244,25 mg de ácido gálico por grama). A infusão também manteve alta estabilidade (acima de 98% e 82%, respetivamente) para TFC (53,30–55,84 mg rutina por grama ) e TTC (102,15–124,20 mg epicatequina por grama ), com AOC estável (> 90%) potente (1,5 –2,2 mmol Trolox por grama ) durante 0–24 h de armazenamento. A principal diminuição foi observada durante 0–2 h de armazenamento de TFC, 8–24 h de armazenamento de TTC e 0–4 h de armazenamento de AOC. A análise cromatográfica revelou ainda que 7 compostos diminuram e 11 compostos aumentaram ao longo de 0-24 h de armazenamento. A boa estabilidade dos polifenóis totais e propriedades antioxidantes podem estar relacionadas à conversão complexa e compensação de atividade entre esses compostos. Estes resultados sugerem que a infusão de folhas de romã pode ser de grande interesse na valorização de subprodutos de alto valor acrescentado e na aplicação de alternativas verdes e funcionais nas indústrias alimentares,farmacêutica e nutracêutica. Os resultados da experiência com animais indicaram que a infusão de PGL foi segura uma vez que não foi observada qualquer mortalidade entre os ratos, distúrbios comportamentais e diferenças significativas nos níveis de microhematócrito, bioquímica sérica, histologia e estresse oxidativo entre os grupos do tipo selvagem. A análise histológica revelou que os animais transgénicos que consumiram infusão reduziram as lesões hepáticas, renais e cutâneas comparativamente ao grupo controle transgénico (água potável), cuja infusão de baixa concnetração diminuiu significativamente as lesões de hidronefrose renal e aliviou as lesões de displasia e carcinoma na pele do tórax. A análise do estresse oxidativo mostrou que a infusão de baixa dose pode ter mais benefícios do que a alta dosagem. Esses resultados sugerem que a administração oral de infusão de PGL, particularmente com concentrações mais baixas, tem potencial antitumoral e quimioterápico contra lesões neoplásicas induzidas pelo HPV16. Em conclusão, este trabalho forneceu uma informação cumulativa aprofundada sobre a composição fenólica abundante e os altos níveis de concentração fenólica e capacidade antioxidante das folhas de romã. Além disso, a alta estabilidade da infusão de PGL, bem como sua natureza não tóxica e propriedades antitumorais contra rins e pulmões neoplásicos induzidos por HPV16 em camundongos, permitiram enriquecer o perfil benéfico para a saúde do PGL, sugerindo para futuros ensaios clínicos e utilização em indústrias relevantes.

Exploiting natural by-products and developing therapeutic application from existing plant resources has gradually attracted worldwide attention for considerable healthy, economic, and environmental benefits. Punica granatum L., commonly known as pomegranate belonging to the Punicaceae family, has become to be an essential medicinal and fruit crop which is broadly consumed throughout the world. Not only the consumption of pomegranate fruit juice, but also the use of its non-edible anatomical compartments has a long ethnomedical history and accepts a numerous preclinical and/or clinical studies nowadays. Amongst, pomegranate leaves (PGL), as agricultural and industrial wastes have got increasingly scientific interest recently, being a reservoir of beneficial nutrients and bioactive phytochemicals. Particularly, the complex (poly)phenolic composition and their synergistic interaction, including ellagic acid, ellagitannins, flavonoids, phenolic acids, among others, endows PGL with various health-promoting effects, such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-hyperlipidemic, anti-hyperglycemic, anti-microbial, anti-cancer, and anti-parasitic properties, as well as protective impacts on the brain, lung, liver, and kidneys. However, the degree of these activities depends on the structural diversity of polyphenolic constituents which have highly bioactivity due to the number and location of hydroxyl and galloyl groups, thus possibly causing degradation, oxidation, epimerization and polymerization of active compounds during food processing. To our best knowledge, there are few researches on the stronger antioxidant capacity of PGL as compared to other renowned medicinal and food plants. The current literature has scarce information on the stability of PGL extracts. More biological and pharmacological profiles of PGL need to be explored and illustrated by preclinical and clinic assays. Besides, the superiority of PGL has not yet emphasized and reviewed thoroughly, though many researchers have outlined the importance of pomegranate fruit. Therefore, the present work aimed to characterize the phenolic components and antioxidant properties of leaves collected from seven medicinal and food plants, including sage, rosemary, rue, peppermint, parsley, olive, and pomegranate, all grown in the northern Portugal. The variation of polyphenolic composition and antioxidant capacity of freshly prepared PGL infusions was evaluated during one-day storage at room temperature to demonstrate the high stability of the infusion. In addition, the anti-neoplastic and chemo-therapeutic, as well as toxicological properties of PGL infusion was conducted in the transgenic mice carrying human papillomavirus (HPV) type 16 oncogenes to expand the future pharmacological application of PGL. For these purposes, leaves of these seven plants referred above were harvested in their full-bloom stage to obtain highest content of phenolics. The total phenolic content (TPC), total ortho-diphenol content (TOC), total flavonoid content (TFC), and total tannin content (TTC), as well as the antioxidant capacities (AOC) measured by the diammonium cation (ABTS) radical and 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH) radical scavenging assay and ferric reducing antioxidant power (FRAP) approach were performed based on the spectrophotometric principles. Phenolic profiles were identified by the authentic standards resorting to Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector (RP-HPLC-DAD) analysis and with comparison to the literature by the retention time, UV/Visible λmax, and spectra. Pearson correlation coefficient (PCC) and principal component analysis (PCA) were carried out to correlate phenolic composition and antioxidant capacity, and to explain the effective variables that affect the sample similarities and differences. Moreover, male transgenic (carrying HPV 16) mice with FVB/n background were exposed to low-dose (0.5%) and high-dose (1.0%) PGL infusions during 4 consecutive weeks. Animals´ body weight, drink, and food consumption were recorded. Internal organs, skin samples, and intracardiac blood were collected to evaluate toxicological parameters, neoplastic lesions, and oxidative stress. In the hydro-methanolic extracts of seven medicinal and food plants, PGL extracts displayed the highest TPC (199.26 mg gallic acid per gram of plant dry weight), TOC (391.76 mg gallic acid per gram of plant dry weight), and TTC (99.20 mg epicatechin per gram of plant dry weight), besides a higher TFC (24 mg catechin per gram of plant dry weight). The highest AOC measured by ABTS, DPPH, and FRAP methods (2.14, 2.27, and 2.33 mmol Trolox per gram of plant dry weight, respectively) was also obtained in PGL extracts, being 4–200 times higher than the other species. Such potent antioxidant capacity of PGL can be ascribed to the presence of different types of phenolic compounds and the high content in tannins, whilst phenolic acids and flavonoids were found to be the dominant phenolic classes of the other six plants. Consequently, despite the well-known antioxidant properties of these plant species, our study suggests that pomegranate leaves can stand out as a relatively more valuable plant source of natural bioactive molecules for developing novel functional food-pharma ingredients, with potential for, not only promoting human health, but also improving bio-valorization and environment. Study on the PGL infusion revealed that no significant changes were found in TPC (131.40–133.47 mg gallic acid per gram) and TOC (239.91–244.25 mg gallic acid per gram). The infusion also maintained high stability (over 98% and 82%, respectively) for TFC (53.30–55.84 mg rutin per gram) and TTC (102.15–124.20 mg epicatechin per gram), with stable (> 90%) potent AOC (1.5–2.2 mmol Trolox per gram) throughout 0–24 h storage. The main decrease was observed during 0–2 h storage of TFC, 8–24 h storage of TTC, and 0–4 h storage of AOC. Chromatographic analysis further revealed that 7 decreased and 11 increased compounds were found within 0–24 h storage. The good stability of the total polyphenolics and antioxidant properties might be related to the complex conversion and activity compensation among these compounds. The findings suggest that pomegranate leaf infusion could be of great interest in the valorization of high added-value by-products and in the application of green and functional alternatives in the food-pharma and nutraceutical industries. Results of animal experiments indicated that PGL infusion was safe for no mortality, no behavioural disorders and no significant differences in the levels of microhematocrit, serum biochemistry, histology, and oxidative stress among wild-type groups. Histological analysis revealed the transgenic animals that consumed infusion reduced hepatic, renal, and cutaneous lesions than the transgenic control group (drinking water), amongst, low-dose infusion significantly diminished renal hydronephrosis lesions and relieved dysplasia and carcinoma lesions in the chest skin. Oxidative stress analysis showed low-dose infusion may have more benefits than high dosage. These results suggested that oral administration of PGL infusion, particularly with lower dosages, has antitumoral and chemotherapeutic potential against HPV16-induced neoplastic lesions. In conclusion, this work provided a cumulative in-depth information on the abundant phenolic composition, and high levels of phenolic concentration and antioxidant capacities of pomegranate leaves. Furthermore, the highly stability of PGL infusion as well as its non-toxic nature and anti-tumoral properties against HPV16-induced neoplastic kidneys and chest skins in mice allowed to enrich the health beneficial profile of PGL and to suggest it towards future clinic trials and utilization in relevant industries.

Manyou Yu received a PhD studentship from the FCT - Portuguese Foundation for Science and Technology (PD/BD/135333/2017), under the Doctoral Programme ‘Agricultural Production Chains - from fork to farm’ (PD/00122/2012). This study was supported by National Funds by FCT - Portuguese Foundation for Science and Technology, under the project UIDB/04033/2020.