Antibiotic resistance and biofilm formation of Enterobacteriaceae isolated from seagulls and their environments in Berlenga Grande and Northern Portuguese beaches

Enterobacteriaceae é uma família de bactérias essencialmente ubíquas, com grande capacidade de sobrevivência e proliferação quer no ambiente quer na microbiota de animais. Assim sendo, são organismos muito propícios à receção e distribuição de genes de resistência a antibióticos e mecanismos de defesa/proteção, tornando-se num grupo que inclui espécies de elevada importância médica devido à gravidade de doenças e danos que podem causar aos organismos que infetarem, e ao aumento da dificuldade de tratamento de tais infeções devido à inevitável escassez de antibióticos ainda eficazes. Este projeto propõe explorar quais genes de resistência estarão presentes em Enterobacteriaceae isoladas de amostras de animais selvagens, solo, água salgada e água estagnada de vários pontos do país, assim como a sua capacidade de construção de biofilme, um mecanismo de defesa que permite a uma colónia sobreviver a agressões medicamentosas e físicas, indicador da sua virulência. Recolheram-se 265 amostras entre outubro de 2021 e outubro 2022 da Berlenga Grande (n=100), de Aver-o-Mar (n=55), de Miramar (n=60) e de Matosinhos (n=50), e obtiveram-se 46 isolados de Klebsiella spp. e 39 isolados de E. coli. Testou-se o fenótipo e genótipo de resistência de todos os isolados, sendo que dos 46 isolados de Klebsiella spp., 73% foram resistentes à ampicilina, 21,3% à amoxicilina e ao ácido clavulânico, 26% à cefoxitina e 82,6% à gentamicina. No entanto, todos foram suscetíveis a estreptomicina, imipenem, meropenem e trimetoprim + sulfametoxazol, e amplificaram os genes aac(3)-II, aac(3)-IV, blaCTX-M, blaTEM, blaVIM e blaSHV. ; 13 isolados de Klebsiella spp. provaram ser MDR. Quanto aos 39 isolados de E. coli, todos foram resistentes à gentamicina., sendo 25,6% a ampicilina, 23% a amoxicilina e ácido clavulânico, 20,5% a cefotaxima e 20,5% a tetraciclina e todos os isolados foram suscetíveis ao imipenem e meropenem. 10 isolados de E. coli foram MDR, 6 deles produtores de ESBL; os isolados de E. coli amplificaram os genes blaCTX-M, blaVIM, blaTEM, blaSHV, tetA, sul1, sul2 e mcr-1. No que toca a biofilmes, todos os isolados de ambas espécies demonstraram ser produtores de biofilme, de moderados a fortes. Dá-se um destaque à diferença estatisticamente significativa entre a produção de biomassa de biofilme dos isolados de fezes de gaivota e a produção dos isolados ambientais. Este estudo apoia a hipótese de que os ambientes costeiros e a vida selvagem nesses ambientes são berços de mecanismos de resistência a antibióticos e podem até ser uma fonte de infeção em indivíduos imunodeprimidos. Mais investigação é necessária, principalmente para testar a virulência destes isolados e confirmar genes de formação de biofilme, bem como outros genes de resistência, que poderão explicar os fenótipos de resistência observados. Salienta também a necessidade de um relatório anual sobre as resistências aos antibióticos mais importantes encontradas no ambiente e, potencialmente, em animais selvagens, a fim de abordar todos os aspetos da filosofia “One Health”: os seres humanos, o ambiente e a saúde veterinária.

Enterobacteriaceae is a family of essentially ubiquitous bacteria, with great capacity for survival and proliferation both in the environment and in the microbiota of animals. Therefore, they are organisms very prone to the reception and distribution of antibiotic resistance genes and defence/protection mechanisms, becoming a group that includes species of high medical importance due to the severity of diseases and damage they can cause to the organisms they infect, and the increased difficulty of treating such infections due to the inevitable shortage of still effective antibiotics. This project proposes to explore which resistance genes will be present in Enterobacteriaceae isolated from samples of wild animals, soil, saltwater and stagnant water from various parts of the country, as well as its ability to build biofilm, a defence mechanism that allows a colony to survive drug-induced and physical aggressions, an indicator of its virulence. A total of 265 samples were collected between October 2021 and October 2022 from Berlenga Grande (n=100), Aver-o-Mar (n=55), Miramar (n=60) and Matosinhos (n=50), and 46 isolates of Klebsiella spp. and 39 isolates of E. coli were obtained. The resistance phenotype and genotype of all isolates was tested, and of the 46 isolates of Klebsiella spp., 73% were resistant to ampicillin, 21.3% to amoxicillin and clavulanic acid (30 µg), 26% to cefoxitin (30 µg) and 82.6% to gentamicin (10 µg). However, all were susceptible to streptomycin (10 µg), imipenem (10 µg), meropenem (10 µg), and trimethoprim + sulfamethoxazole (25 µg) , and amplified the aac(3)-II, aac(3)-IV, blaCTX-M, blaTEM, blaVIM, and blaSHV genes. Thirteen isolates of Klebsiella spp. proved to be MDR. Of the 39 E. coli isolates, all were resistant to gentamicin (10 µg) , 25.6% to ampicillin (10 µg), 23% to amoxicillin and clavulanic acid (30 µg), 20.5% to cefotaxime (30 µg) and 20.5% to tetracycline (30 µg), and all isolates were susceptible to imipenem (10 µg) and meropenem (10 µg). 10 E. coli isolates were MDR, 6 of them ESBL producers; E. coli isolates amplified blaCTX-M, blaVIM, blaTEM, blaSHV, tetA, sul1, sul2 and mcr1 genes. Regarding biofilms, all isolates of both species were shown to be moderate to strong biofilm producers. The statistically significant difference between the biofilm biomass production of seagull faeces isolates and the production of environmental isolates is highlighted. This study supports the hypothesis that coastal environments and wildlife in these environments are birthplaces of antibiotic resistance mechanisms and may even be a source of infection in immune compromised individuals. Further research is needed, primarily to test the virulence of these isolates, and to confirm biofilm formation genes as well as other resistance genes, which may explain resistance phenotypes observed. It emphasizes the need for an annual report on the most important antibiotic resistances found in the environment and potentially in wildlife, to address all aspects of the ‘One Health’ philosophy: humans, the environment, and veterinary health.