Efecto del silenciamiento de la fosfoenolpiruvato carboxilasa 3 (sbppc3) en condiciones control y de estrés abiótico en plantas de sorgo (sorghum bicolor)

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica multifuncional que está implicada en procesos clave del metabolismo del carbono y del nitrógeno. La PEPC cataliza la ß-carboxilación irreversible del fosfoenolpiruvato (PEP) para formar oxalacetato (OAA) y fosfato inorgánico (Pi). Realiza el primer paso de carboxilación en la fotosíntesis C4 y CAM, y además tiene importantes funciones no fotosintéticas que coordinan el metabolismo C/N en diferentes contextos fisiológicos. En sorgo (Sorghum bicolor), especie utilizada en este trabajo, la PEPC está formada por una pequeña familia génica formada por 6 genes: SbPPC1 que codifica la isoforma fotosintética, SbPPC2-5 que codifican enzimas de tipo C3 y SbPPC6 codifica la isoforma de tipo bacteriano. Este trabajo se ha centrado en la isoforma SbPPC3, isoforma mayoritaria en raíces aunque presente en el resto de tejidos como semillas y hojas, donde también desarrolla importantes funciones. Nuestro grupo de investigación puso en evidencia el papel de la isoforma PPC3 de Arabidopsis, homóloga funcional de la PPC3 de sorgo, en el desarrollo de la planta, desde la formación y la germinación de semillas, durante el desarrollo vegetativo, y hasta el desarrollo reproductivo. Por otro lado, distintas evidencias experimentales mostraban la importancia de isoenzimas PEPC no fotosintéticas en respuestas a estrés, específicamente en raíces. En este trabajo de tesis se ha analizado el papel de la isoforma PPC3 en plantas de sorgo cultivadas en condiciones control y de estrés abiótico, principalmente salino y por amonio, tanto en hojas como en raíces, utilizando para ello una valiosa herramienta como es una planta modificada genéticamente donde se ha silenciado la expresión del gen que codifica la enzima. El abordaje del análisis se ha realizado a diversos niveles de estudio, desde el nivel molecular al nivel de tejidos y planta completa, pasando por el nivel bioquímico y celular. Además, hemos hecho uso de distintas “ómicas” como son la transcriptómica y la metabolómica, lo que ha arrojado una ingente cantidad de datos e información que demuestran lo variado de las respuestas de la planta a las situaciones externas adversas, y el papel particular que juega la isoenzima PPC3 en ellas. El silenciamiento de PPC3 tuvo una repercusión morfológica y fisiológica, reduciendo el tamaño, biomasa y producción de las plantas transformadas, además de causar un retraso en la floración y en la germinación de las semillas. A pesar de ser una isoforma no fotosintética, se ha observado una repercusión en parámetros fotosintéticos, con una reducción de la apertura estomática en las líneas silenciadas, lo que indica un papel de esa isoforma en el control estomático. Las repercusiones a nivel transcriptómico del silenciamiento de PPC3 no han sido dramáticas, aunque si interesantes, con una mayor incidencia en hojas que en raíces y afectado principalmente a genes implicados en procesos del catabolismo de macromoléculas de la pared celular o procesos de fosforilación de proteínas. A nivel metabólico, sí se ha observado un efecto más profundo, con un desequilibrio del metabolismo del carbono y el nitrógeno, tanto en hojas como en raíces. En hojas, con una disminución generalizada de ácidos orgánicos y aminoácidos, y en raíces con un patrón opuesto. Además, se observó una activación de rutas de fermentación en raíces que causó un aumento de lactato. La salinidad implica una combinación de estrés osmótico e iónico que afecta muchos aspectos fisiológicos de una planta. Principalmente inhibe el crecimiento de las plantas e influye en etapas clave de su desarrollo, desencadenando la senescencia prematura, disminución de la producción e incluso la muerte durante una exposición prolongada. Además, se ha documentado un efecto muy marcado en procesos como la fotosíntesis, la síntesis de proteínas, el metabolismo energético o el metabolismo de los lípidos. Las plantas muestran cambios específicos fisiológicos, en la expresión de genes y/o en el metabolismo como respuesta a diferentes condiciones ambientales. En sorgo, planta con tolerancia moderada/alta a la salinidad, la sal tuvo un efecto a distintos niveles, afectando a procesos fisiológicos como el crecimiento, la biomasa o la productividad, e incluso aumentando la producción de osmolitos protectores como la prolina. A nivel transcriptómico, la salinidad tuvo una mayor repercusión en raíces, afectando principalmente a procesos de fosforilación de proteínas, de respuestas de defensa o catabolismo de quitina. Por otro lado, se observó un efecto claro de la salinidad en el metabolismo de la planta con una mayor producción de ácidos orgánicos, aminoácidos y azúcares. La PEPC tiene un papel importante en la respuesta a la salinidad en sorgo. Ante estrés salino se produce un aumento de expresión y acumulación de PEPC en raíces, y todo parece indicar que la enzima responsable de esta respuesta es SbPPC3 ya que en las líneas silenciadas esta acumulación no se produce. Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren un importante papel de SbPPC3 en el desarrollo y germinación de la semilla. El retraso observado en la germinación de las semillas de las plantas silenciadas podría conferir cierta resistencia a la salinidad en estadios iniciales de la germinación, efecto que luego desaparece al comenzar el vegetativo, aumentando la sensibilidad al estrés salino con repercusiones drásticas sobre aspectos fisiológicos de la planta. En conjunto, podemos decir que la isoforma de PEPC SbPPC3 tiene papeles en diferentes tejidos y contextos fisiológicos, participando en procesos tan diversos como la apertura estomática o el metabolismo glucolítico de hojas y raíces, afectando tanto al crecimiento vegetativo como al reproductivo de la planta, y todo ello en condiciones normales y también de salinidad. La salinidad tiene un profundo impacto tanto en el transcriptoma como en el metaboloma de la planta, y la falta de PPC3 provoca que estos cambios sean aún mayores. Esto se traduce en que los efectos negativos del estrés sobre el crecimiento y productividad de las plantas a largo plazo se ven acentuados en las plantas silenciadas, en comparación con las silvestres. Por todo ello, podemos concluir que la isoforma PPC3 juega papeles cruciales a distintos niveles en el metabolismo de la planta en condiciones control y de estrés, y que podría suponer una diana importante de mejora y selección para la resistencia de plantas de interés antes situaciones adversas. Por último, debido a la complejidad del metabolismo bioquímico vegetal y a los diversos puntos donde la PEPC puede tener un papel, la isoforma PPC3 probablemente juegue un papel importante en otros contextos fisiológicos, lo cual debe ser tenido en cuenta para futuros trabajos. En este sentido, tiene especial interés el futuro análisis cualitativo de las semillas de las líneas silenciadas. Los resultados obtenidos indican que la carencia de PPC3 no sólo tiene repercusiones sobre la producción cuantitativa de semillas, sino que también puede afectar a su calidad nutricional. Las alteraciones metabólicas encontradas en las partes vegetativas se trasladarán presumiblemente a las semillas, afectando, por ejemplo, a aminoácidos como la Lys, especialmente relevante para la calidad nutricional del grano de los cereales.