Respuestas a estrés abiótico en plantas de sorgo (Sorghum bicolor L.) con la fosfoenolpiruvato carboxilasa 3 (SbPPC3) o con las fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasas 1-3 (SbPPCK1-3) silenciadas

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica multifuncional que cataliza la β-carboxilación oxidativa del fosfoenolpiruvato (PEP) produciendo oxalacetato (OAA) y fósforo inorgánico (Pi). Es la responsable de la fijación inicial del CO2 en plantas con fotosíntesis de tipo C4 y en plantas CAM, además tiene importantes funciones no fotosintéticas. Al tratarse de una enzima con un papel central en el metabolismo, se encuentra altamente regulada. La PEPC es regulada mediante varias modificaciones postraduccionales (PTMs) que regulan tanto su estabilidad como su actividad de formas complejas. Una de las modificaciones más conocidas consiste en la fosforilación reversible de la PEPC. Ésta incrementa la actividad de la PEPC y es llevada a cabo por la PEPC-quinasa (PEPCk), una proteína quinasa perteneciente a la familia de las quinasas dependientes de calcio (superfamilia CDPK), pero cuya actividad es independiente de éste. A su vez, la expresión, la estabilidad y la actividad de la PEPCk puede ser modificada en diferentes condiciones fisiológicas. En sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), la especie utilizada en esta tesis, existen 6 isoformas de la PEPC: SbPPC1, que codifica la PEPC C4; SbPPC2-5, que codifican las PEPC de tipo C3 y SbPPC6, que codifica la PEPC de tipo bacteriano. Además, en sorgo, la PEPCK constituye una familia génica formada por 3 genes: SbPPCK1, que codifica la isoforma fotosintética; SbPPCK2, presente en hojas y raíces e inducida por estrés y SbPPCK3, que codifica una isoforma poco caracterizada. Esta tesis doctoral está dividida en dos grandes bloques. Por un lado, el estudio del papel de una de las isoformas de la PEPC, SbPPC3, en distintas condiciones de estrés abiótico y, por otro lado, la caracterización inicial de plantas de sorgo con los genes SbPPCK silenciados mediante ARNi. Estudios previos desarrollados por nuestro grupo de investigación encontraron que la isoenzima SbPPC3 es importante en la respuesta frente a estreses abióticos como la sal o el exceso de amonio en raíces de sorgo. Para profundizar en el estudio del papel de SbPPC3, se obtuvieron líneas de sorgo con el gen SbPPC3 silenciado mediante ARNi. La caracterización de esas líneas puso de manifiesto que SbPPC3 no sólo es la isoforma de PEPC predominante en raíces y en la respuesta a estreses en este tejido, sino que también tiene importantes repercusiones sobre el desarrollo vegetativo de la planta, la formación y germinación de semillas y la apertura y el cierre estomático. Resultado de todas estas importantes funciones, se decidió continuar estudiando el papel de SbPPC3 en otras situaciones de estrés abiótico: la toxicidad por metales (aluminio y cadmio) y la deficiencia de fósforo. La toxicidad por metales como el aluminio o el cadmio altera múltiples procesos fisiológicos de una planta, la fotosíntesis, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), y la absorción de nutrientes, que pueden causar déficits nutricionales. Todo esto tiene como resultado la inhibición del crecimiento. En sorgo, hemos encontrado que estos metales reducen el crecimiento y aumentan el estrés oxidativo. Además, el cadmio altera la absorción de otros elementos y el aluminio incrementa el contenido de antocianinas. Algunas de estas respuestas y cambios fueron mayores en las líneas silenciadas, indicando una mayor sensibilidad a estos estreses como consecuencia de la falta de PPC3. La PEPC tiene un papel importante en la respuesta a estrés por metales en sorgo. Estos estreses aumentan la expresión y la cantidad de PEPC presente en raíces. Este incremento en la actividad enzimática está asociada principalmente a la isoforma PPC3, ya que no se produce en las líneas silenciadas. Además, la carencia de esta enzima repercute en la secreción de ácidos orgánicos, que actúan como quelantes de los iones metálicos evitando la toxicidad para la planta. En el tratamiento con Al a corto plazo no se encontraron diferencias en la cantidad de citrato en los exudados radicales. Por el contrario, en los tratamientos a más largo plazo con Cd, se observó una notable disminución de la cantidad de citrato en los exudados de las líneas silenciadas. Estos resultados muestran que SbPPC3 tiene un papel importante en el mantenimiento de una síntesis prolongada de ácidos orgánicos, como el citrato, en la respuesta a la toxicidad por metales. El fósforo es uno de los nutrientes más importantes en plantas y su deficiencia en suelos suponen un problema agrícola a nivel global. El déficit de fósforo altera la fisiología y el metabolismo de la planta en múltiples niveles. Al igual que en la respuesta a los metales, uno de los papeles de la PEPC en deficiencia de fósforo está asociado al mantenimiento de la síntesis de ácidos orgánicos a largo plazo. Hemos encontramos que la falta de fósforo incrementa la actividad PEPC en raíces WT, pero no en las líneas silenciadas. El silenciamiento de PPC3 reduce la respuesta en la relación raíz/parte aérea respecto a la encontrada en la planta WT bajo deficiencia de fósforo. Además, en las plantas modificadas algunas de las respuestas a falta de fósforo se mantienen al ser tratadas con fosfato insoluble, mientras que en las plantas WT estas respuestas desaparecen. Este fue el caso de parámetros como el contenido de antocianinas y la fosforilación de la PEPC en hojas o la expresión del transportador de fosfato (SbPHT) en raíces. Además, cabe destacar que las líneas Ppc3 tienen una menor cantidad de fósforo en raíces que las plantas WT en el tratamiento con fosfato insoluble. Todo esto indica que el silenciamiento de SbPPC3 repercute sobre la capacidad de solubilización del fósforo, provocando que en las líneas modificadas se mantenga la respuesta a la deficiencia de fósforo en presencia de fosfato insoluble. Estos resultados muestran que la isoforma PPC3, además de ser la isoforma predominante en raíces, tiene un importante papel en las respuestas frente a estreses que se sensan y desencadenan respuestas en dicho tejido. Entre ellas, las que implican el mantenimiento de una alta síntesis de ácidos orgánicos de forma prolongada. Estos resultados, junto a las importantes funciones de esta isoforma en otros tejidos y contextos fisiológicos, la convierten en una posible diana de mejora vegetal en el futuro. En el segundo bloque de la tesis, se han obtenido plantas de sorgo con los genes SbPPCK1-3 silenciados mediante la técnica del ARNi. Con esto, se han logrado obtener líneas modificadas que mantenían menores niveles de fosforilación de la PEPC en hojas, incluso en condiciones que aumentan esta modificación postraduccional. El silenciamiento de SbPPCK1-3 afecta modestamente al crecimiento y desarrollo de las plantas de sorgo. Los principales efectos se encontraron sobre el tiempo de floración y sobre la producción de las semillas, así como sobre la composición de las mismas, afectando a importantes parámetros de calidad nutricional. La caracterización inicial de estas plantas modificadas ha permitido encontrar posibles e interesantes líneas de investigación sobre los genes SbPPCK1-3. Entre todas, hay que destacar el estudio de las funciones de la PEPCk sobre la floración y la producción y la germinación de semillas, investigaciones futuras que podrían desarrollarse en distintas condiciones de estrés. También sería importante profundizar en la investigación de los efectos del silenciamiento de SbPPCK1-3 sobre la calidad nutricional de las semillas. Además, sería interesante estudiar los cambios metabólicos causado por este silenciamiento en distintos contextos fisiológicos. Todo ello, nos permitiría conocer en mayor medida la importancia de la fosforilación de la PEPC en distintos procesos y condiciones fisiológicas.