Detecting protein interactions in space using in situ proximity ligation assay (isPLA) and multiplexed imaging | Detektering av proteininteraktioner in situ med hjälp av in situ proximity ligation assay (isPLA) och multiplexed imaging

Immune checkpoint-hämmande behandlingar riktade mot PD-1/PD-L1-axeln rekommenderas som förstahandsval för patienter som inte är lämpliga för kemoterapi med cisplatin och som har PD-L1-positiva tumörer. Responsen på Pembrolizumab, en PD-1-hämmare, är dock endast mellan 21% och 29%. Detta kan bero på att endast cirka 10% av tumören och de antigenpresenterande cellerna behöver vara positiva för PD-L1 för att tumören ska anses vara PD-L1-positiv. Denna poängsättning, som vanligtvis görs med hjälp av immunohistokemi, visar inte heller om det finns en aktiv PD-1/PD-L1-interaktion och tar inte hänsyn till komplexiteten i andra molekylära interaktioner i tumörens mikromiljö.  Detta projekt syftade först till att utveckla en integrerad metod som kombinerar in situ proximity ligation assay (isPLA) och multiplex immunofluorescens på PhenoCycler-plattformen för att få ytterligare insikt i den roll som PD-1/PD-L1-interaktionen spelar i svaret på immuncheckpoint-hämmande behandling med Pembrolizumab. En panel med 15 andra proteinmarkörer möjliggjorde samtidig visualisering av immunceller, tumörceller, strukturella markörer och proliferationsmarkörer i samma vävnadsprov för att underlätta fenotypningen av celler i vävnaden. Projektets andra mål var att tillämpa den integrerade metoden på en retrospektiv kohort av 11 patienter som behandlats med Pembrolizumab, för att undersöka korrelation mellan PD-1/PD-L1 interaktion och respons på Pembrolizumb.  Den integrerade metoden med isPLA och multiplex immunofluorescens tillämpades framgångsrikt på urinblåsecancerprover på PhenoCycler-plattformen efter flera optimeringsexperiment. Tillämpningen av metoden på 11 fall från en retrospektiv kohort visade att prover från patienter som inte svarat på behandlingen uppvisade färre PD-1/PD-L1-interaktioner jämfört med prover från patienter som svarat på behandlingen, vilket tyder på att det kan finnas ett samband mellan förekomsten av PD-1/PD-L1-interaktioner och svar på behandlingen. Denna integrerade metod kommer att testas ytterligare på cirka 90 andra prover från den retrospektiva kohorten, för att förbättra förutsägelsen av vem som skulle gynnas av behandling med Pembrolizumab och därmed öka svarsfrekvensen och minska risken för onödiga biverkningar. Dessa resultat fungerar också som ett proof-of-concept för integrering av isPLA-data med en multiplex immunofluorescens plattform, vilket skulle kunna utvidgas till att omfatta studier av andra protein-protein-interaktioner.

Immune checkpoint inhibition therapies targeting the PD-1/PD-L1 axis are recommended as first-line options for patients who are ineligible for cisplatin chemotherapy and with PD-L1 positive tumors. However, response to Pembrolizumab, a PD-1 inhibitor, is only between 21% and 29%. This might be because only about 10% of tumor and antigen presenting cells need to be positive to PD-L1 for the tumor to be considered PD-L1 positive. Moreover, this scoring, usually performed using immunohistochemistry, does not indicate whether there is active PD-1/PD-L1 interaction, nor takes into consideration the complexity of other molecular interactions within the tumor microenvironment.  This project aimed first at developing an integrated approach combining in situ proximity ligation assay (isPLA) and multiplexed immunofluorescence on the PhenoCycler platform to gain further insight into the role played by the PD-1/PD-L1 interaction in the response to immune checkpoint inhibition therapy with Pembrolizumab. A panel of 15 other protein markers allowed the simultaneous visualization of immune cells, tumor cells, structural and proliferation markers within the same tissue sample to aid with the phenotyping of cells in the tissue. The second aim of the project was then to apply the integrated method on a retrospective cohort of 11 patients treated with Pembrolizumab, to explore correlation between PD-1/PD-L1 interactions and response to Pembrolizumab.  The integrated isPLA and multiplexed immunofluorescence method was successfully applied to bladder cancer samples on the PhenoCycler platform, following several optimization experiments. The application of the method on 11 cases from a retrospective cohort indicated that samples from non-responders showed fewer PD-1/PD-L1 interactions compared to samples from responders, suggesting that there might be a correlation between the presence of PD-1/PD-L1 interactions and response. This integrated method will be further tested on about 90 other samples from the retrospective cohort, to improve the prediction of who would benefit from Pembrolizumab therapy and thus increase response rates, reducing the risk of unnecessary side effects. These results also serve as a proof-of-concept for the integration of isPLA data with a multiplex immunofluorescence platform, which could be extended to the study of other protein-protein interactions.