Epigenetic and phenotypic plasticity as mediators of resistance to oncogenic pathway targeting

Inglés. Therapy resistance represents a hallmark of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and is understood as a multifactorial process. The present work integrated comprehensive (epi-)genomics, transcriptome and proteome analyses complemented by functional assays to study MEK inhibitor (MEKi) resistance in PDAC at different levels of regulation. This multi-omics approach was applied to an in vitro model based on primary cell lines derived from a genetically modified mouse model that develops spontaneous PDAC. Thereby, influencing factors such as interindividual differences and stromal cell contamination were minimized in order to prevent distortion of global analyses. All ten initially MEKi sensitive cell lines analyzed were able to develop resistance independently of a tumor microenvironment, indicating that in this model system, resistance relied on cell-intrinsic mechanisms. The resistant cells emerged based on the expansion of a single cell clone, but whole genome sequencing revealed no evidence for resistance as a direct consequence of pre-existing or acquired mutations. The underlying mechanism was associated with phenotypic plasticity involving epithelial-to-mesenchymal transition in accordance with a PDAC subtype switch to the more aggressive mesenchymal-like subtype. In addition, reversibility of the resistant phenotype was observed in the absence of MEKi. The inclusion of this third state in an unbiased genome-wide DNA methylation analysis enabled the identification of differentially methylated regions that correlated with the degree of MEKi resistance. An adaptive DNA hypermethylation pattern was linked to regulatory elements such as active enhancers and transcription factor binding sites. By integrating methylome with expression data a methylation associated modulation of CASP3 expression and activity was identified. The resulting attenuation of treatment-induced apoptosis could be reversed by DNA methyltransferase inhibition, for which a remarkable sensitivity was detected exclusively in the resistant cells. Overall, it was possible to embed known resistance phenomena as tumor subtype switching and cell death evasion into the context of comprehensive (epi-)genomics.This study proposes a concept of MEKi resistance in PDAC based on the selection of a cell clone with epigenetic plasticity that enables treatment adaption. The identified dynamic DNA methylation changes in the presence and absence of MEKi and the distinct vulnerability of the resistant cells to DNA methyltransferase inhibitors hold the potential to improve MEKi-based therapy of PDAC patients.

Alemán. Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist durch eine enorme Resistenz gegen alle bisher getesteten Therapien gekennzeichnet, deren Ursache weitgehend unverstanden und vermutlich multifaktoriell ist. Um verschiedene Regulationsebenen in MEK-Inhibitor (MEKi) resistentem PDAC zu untersuchen, wurden (Epi-)Genom-, Transkriptom- und Proteomanalysen integriert und durch funktionelle Analysen ergänzt. Dazu wurde ein auf primären, von einem genetisch modifizierten Maus-Modell abgeleiteten, PDAC Zelllinien basierendes in vitro Modell generiert. Trotz fehlendem Tumorstroma entwickelten alle zehn initial MEKi sensitiven Zelllinien eine MEKi Resistenz, sodass ein zell-intrinsischer Mechanismus angenommen werden konnte. Die resistente Zellpopulation entstand durch Expansion eines einzelnen Zellklons ohne Hinweise auf direkt resistenzverleihende Mutationen. Der resistente Phänotyp war durch Plastizität gekennzeichnet, die mit epithelialer-mesenchymaler Transition und einem PDAC Subtypen-Wechsel hin zum aggressiveren mesenchymalen Subtyp einherging. Des Weiteren führte die Abwesenheit von MEKi im Kulturmedium zu einem sukzessiven Resistenzverlust. Unter Einbeziehung dieses dritten Zellstadiums war es mittels einer genomweiten DNA Methylierungsanalyse möglich, Regionen zu definieren, deren differentielle Methylierung mit dem Grad der MEKi Resistenz korrelierte. Dabei wurde in den resistenten Zellen eine adaptive DNA Hypermethylierung von regulatorischen Elementen wie Enhancern und Transkriptionsfaktorbindestellen nachgewiesen. Zusätzlich konnte durch Integration der Methylierungsdaten mit Expressionsanalysen die MEKi-abhängige Modulation von CASP3 identifiziert werden. Die daraus resultierende Attenuation von MEKi-induzierter Apoptose wurde durch Inhibition von DNA Methyltransferasen (DNMTs) aufgehoben, wobei nur die resistenten Zellen eine DNMT-Inhibitor Sensitivität aufwiesen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit bekannte Resistenzphänomene wie ein Subtypenwechsel und die Vermeidung von Therapie-induzierter Apoptose in den Kontext umfassender (Epi-)Genomanalysen gesetzt werden. Insgesamt kann aus den Daten ein Konzept von MEKi Resistenz im PDAC als klonale Selektion von Zellen mit epigenetischer Plastizität, die eine Adaption an die Therapie unter anderem durch Attenuation von MEKi-induzierter Apoptose ermöglicht, abgeleitet werden. Zusammen mit den dynamischen DNA Methylierungsänderungen bei An- und Abwesenheit von MEKi birgt die alleinige DNMT-Inhibitor Sensitivität der resistenten Zellen das Potential, MEKi-basierte Therapien von PDAC Patienten zu verbessern.