Developing new strategies to limit MuRF1/TRIM63-mediated muscle protein loss | Développement de nouvelles stratégies pour limiter la perte de protéines musculaires induite par MuRF1/TRIM63

Inglés. Several catabolic conditions (disuse, cachexia, or aging) are characterized by a loss of muscle massand strength mainly due to an increase in skeletal muscle proteolysis. When sustained in time,this muscle weakness contributes to the deterioration of patient’s health, compromises treatmentsand is associated with increased mortality. In this context, proteolysis is mainly orchestrated bythe Ubiquitin Proteasome System (UPS). Among the different actors of the UPS, MuRF1 / TRIM63is a RING-type E3 ubiquitin-ligase considered is a key component in this process and thus a primecandidate for pharmacological treatments. However, MuRF1 / TRIM63 lacks any catalytic activityand depends on the presence of UBE2 (E2) enzymes for targeting proteins for proteasomedependentdegradation. To date, no efficient treatments to prevent or limit muscle wasting havebeen discovered. Therefore, this thesis project aimed to partly fill this gap by understanding themechanisms of muscle atrophy implicating MuRF1/TRIM63, for developing strategies to preventor limit muscle protein loss. By combining in vitro and in cellulo approaches, we characterized theinteractions between MuRF1/TRIM63 and some of its major substrates (!-actin, myosin heavychain [MyHC], etc.). We showed that the identity of the substrate differentially affects theinteraction between MuRF1 and several E2 enzymes, UBE2L3, UBE2J1 and UBE2J2. Among thedifferent E2 enzymes, UBE2L3 appeared to be the most efficient in catabolic C2C12 myotubes, amain effect being observed on the degradation of contractile proteins (!-actin and MyHC).Accordingly, UBE2L3 knockdown in Tibialis anterior muscles induced hypertrophy indexamethasone-treated mice while overexpression of UBE2L3 aggravated muscle atrophy.Regarding UBE2J1 and UBE2J2, at this time, we cannot completely rule out a role on muscleatrophy. Lastly, performing High-Throughput Screening of small-molecule compounds wefound eight potential protein-protein inhibitors for disrupting either MuRF1-UBE2J1 or MuRF1-UBE2J2 couples. Our results demonstrate that the mechanisms involved in contractile proteindegradation are more complicate than previously anticipated with an interplay between MuRF1,an E2 enzyme and the substrate itself. Deciphering the exact biochemical mechanisms ofsarcomeric protein degradation is thus mandatory for developing future therapeutic strategies.

Francés. Plusieurs états cataboliques (désactivité, cachexie ou vieillissement) sont caractérisés par une perte de masseet de force musculaire principalement due à une augmentation de la protéolyse du muscle squelettique. Lorsqu’elle se prolonge dans le temps,cette faiblesse musculaire contribue à la détérioration de la santé du patient, compromet les traitementset est associée à une mortalité accrue. Dans ce contexte, la protéolyse est principalement orchestrée parle système ubiquitine-protéasome (UPS). Parmi les différents acteurs de l’UPS, MuRF1/TRIM63est une ubiquitine-ligase E3 de type RING considérée comme un élément clé de ce processus et donc uncandidat de choix pour les traitements pharmacologiques. Cependant, MuRF1/TRIM63 n’a aucune activité catalytiqueet dépend de la présence d’enzymes UBE2 (E2) pour cibler les protéines pour unedégradation dépendante du protéasome. A ce jour, aucun traitement efficace pour prévenir ou limiter la fonte musculaire n’a été découvert. Ce projet de thèse avait donc pour objectif de combler en partie cette lacune en comprenant lesmécanismes d'atrophie musculaire impliquant MuRF1/TRIM63, afin de développer des stratégies de préventionou de limitation de la perte protéique musculaire. En combinant des approches in vitro et in cellulo, nous avons caractérisé lesinteractions entre MuRF1/TRIM63 et certains de ses substrats majeurs (!-actine, chaîne lourde de lamyosine [MyHC], etc.). Nous avons montré que l'identité du substrat affectedifféremment l'interaction entre MuRF1 et plusieurs enzymes E2, UBE2L3, UBE2J1 et UBE2J2. Parmi lesdifférentes enzymes E2, UBE2L3 s'est avérée la plus efficace dans les myotubes C2C12 cataboliques, uneffet principal étant observé sur la dégradation des protéines contractiles (!-actine et MyHC).En conséquence, la suppression de l'UBE2L3 dans les muscles tibiaux antérieurs a induit une hypertrophie chezdes souris traitées à la dexaméthasone tandis que la surexpression de l'UBE2L3 a aggravé l'atrophie musculaire.En ce qui concerne l'UBE2J1 et l'UBE2J2, à ce stade, nous ne pouvons pas exclure complètement un rôle dansl'atrophie musculaire. Enfin, en effectuant un criblage à haut débit de composés à petites molécules, nousavons trouvé huit inhibiteurs protéine-protéine potentiels pour perturber les couples MuRF1-UBE2J1 ou MuRF1-UBE2J2. Nos résultats démontrent que les mécanismes impliqués dans ladégradation des protéines contractiles sont plus complexes que prévu avec une interactionentre MuRF1, une enzyme E2 et le substrat lui-même. Déchiffrer les mécanismes biochimiques exacts de ladégradation des protéines sarcomériques est donc indispensable pour développer de futures stratégies thérapeutiques.