Functional analysis of the dREQ MITF mutant: Determination of the nuclear localization and transcription activation potential of an MITF mutant lacking three amino acids

Umritunarþátturinn MITF er lykilstjórnprótein í litfrumum þar sem hann er nauðsynlegur fyrir þroskun og virkni þessara fruma. MITF er einnig mikilvægur þáttur í sortuæxlum og veldur kímlínubreyting í geninu aukinni áhættu á myndun sortuæxla. Rannsóknarstofa Evrópu í Sameindalíffræði (EMBL) í Hamborg greindi þrívíddarbyggingu MITF próteinsins árið 2012 í samstarfi við rannsóknarhóp Eiríks Steingrímssonar. Niðurstöður greinarinnar sem birt var í kjölfarið leiddu meðal annars í ljós að tvö stökkbreytt MITF afbrigði sem vantaði hvort um sig þrjár amínósýrur á upphafssvæði leucine zipper hneppis (MITFdel3aa) hafa aðra hæfileika til tvenndarmyndunar en villigerðin. Nýlega hafa samstarfsaðilar í Hamburg ákvarðað kristalbyggingu stökkbreytts próteins sem hefur sams konar úrfellingu á þremur amínósýrum á amínóenda leucine zippersins. Markmið þessa verkefnis var að framkvæma virknigreiningar til þess að skilja betur áhrif stökkbreytingarinnar. Tilraunir sem fólu í sér yfirtjáningu, mótefnalitun og lagsjárgreiningu leiddu í ljós að staðsetning MITFdel3aa var sambærileg við villigerðarprótein sem gefur til kynna að úrfelling á þremur amínósýrum á upphafshluta zipper hneppisins hafi ekki áhrif á staðsetningu próteinsins í kjarna fruma. Stökkbreytta próteinið sýndi einnig sambærilega getu til að virkja umritun frá stýrilsvæði tyrosinasa gensins og ekki reyndist munur á milli ólíkra bindiseta fyrir umritunarþáttinn þegar tilraunir voru gerðar með luciferasa klöguskjóðu. Vinna var hafin við að útbúa breytinguna (del3aa) í erfðamengi SKmel28 fruma með CRISPR/Cas9 aðferðinni en var ekki lokið á tímabilinu.

The transcription factor MITF is considered to be a master regulator of melanocytes because it is necessary for the growth, differentiation and function of these cells. MITF is also an important factor in melanoma and a germline mutation in the gene that confers increased risk of melanoma has previously been described. A research group at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) in Hamburg determined the three-dimensional crystal structure of the MITF protein and published their results in collaboration with the Steingrimsson laboratory in 2012. The results from this paper proposed that two MITF mutants, both containing a three amino acid deletion in the front part of the leucine zipper domain (MITFdel3aa), exhibited different dimerization specificity from the wild type protein. Recently, the same research group in Hamburg determined the crystal structure of an MITF mutant with a mutation in the front part of the zipper domain comparable to that of the aforementioned mutants. The aim of the current study was to perform a functional analysis of this mutated form of MITF to obtain a better understanding of this mutation. Overexpression, immunostaining and confocal imaging were used to determine subcellular localization. Localization of the mutant compared to the wild type protein revealed that the nuclear localization of the transcription factor is not affected by removing the three residues in the front part of the zipper domain. The luciferase reporter assay was used to analyse the transcriptional activation potential of the mutant compared to the wild type protein. This indicated that the mutant could activate expression from the tyrosinase promoter and that activation appeared to be independent of the two DNA binding motifs tested. Further experiments need to be conducted to finish the generation of a human melanoma cell line with the deletion (del3aa) in its genome using the CRISPR/Cas9 technique.