Sperm binding properties to uterine epithelial cells in vitro employing a primary porcine endometrium culture system

Inglés. In pig husbandry the conventional method of intrauterine deposition of an 80-100 ml AI volume containing 1-3 x109 fresh spermatozoa is the commonly used procedure. Compared to bovine insemination, where as little as 2 x106 spermatozoa result in gravities, boar ejaculates have only little efficiency. The only way to utilize low doses of boar sperm is to deposit the semen closer to the site of fertilisation, which is in the distal isthmus of the oviduct. The species-specific binding of spermatozoa, to several surface epithelia in the female tract, foregoing capacitation and hyperactivation, encompasses carbohydrate recognition by lectin-like receptors on the sperm plasma membrane. It was therefore assumed that the putative binding of porcine sperm and uterine epithelia is mediated by specific protein-carbohydrate interactions, too. The aim of this thesis was to establish a reproducible in vitro cell culture model from primary uterine epithelial cells of the sow (Sus scrofa) to examine and identify possible reasons for the high numbers needed in porcine fertilisation. Porcine uterine epithelial cells were harvested by layer-enzymatic digestion with Trypsin/EDTA (1x). Dissemination was carried out on collagen (rat tail, type I) coated glass cover slips in six-well culture dishes. Cells started to adhere to the collagen matrix after 12 to 36 hours and colonies were formed after five to seven days. Confluence could be documented after ten to 15 days. Verification for epithelial cells was completed by immune-fluorescence antibody stain using an epithelial cell-specific primary antibody (marking cytokeratin 19). Porcine spermatozoa bound to UEC within minutes and remained motile. Reduced sperm binding was observed for sperm on porcine aortal epithelia as well as porcine foetal fibroblasts, indicating that porcine uterine epithelia possess specific ligands for porcine sperm surface moieties. Sperm as well as uterine epithelia showed high binding density for lectins affine for Glc-NAc and sialic acid as well as Gal-NAc indicated by high binding intensities from lectins affine for these oligosaccharides, namely wheat germ agglutinin (WGA) and succinylated wheat germ agglutinin (sWGA). The blocking of sialic acid residues on the UEC before sperm incubation resulted in diminished binding density. No effect was seen for blocked Glc-NAc ligands. This shows that the main molecule involved in sperm-UEC interactions most likely is sialic acid.

Alemán. In der Schweinezucht werden konventionell 1-3 x109 Spermien als Frischsamen in einem Volumen von 80-100 ml intrauterin versamt. Im Vergleich zur Rinderbesamung, bei der mitunter 2 x106 Spermien zu Trächtigkeiten führen, sind Ejakulate von Ebern ineffizient. Die einzige Möglichkeit geringe Spermienzahlen erfolgreich zu versamen besteht darin die Spermienablage nahe dem Ort der Befruchtung im distalen Isthmus des Eileiters durchzuführen. Die spezies-spezifische Bindung von Säugerspermien an diverse Oberflächenzellen des weiblichen Traktes, die der Kapazitation und Hyperaktivierung vorangehen, setzt die Erkennung von Kohlenhydraten durch lektin-ähnliche Proteine der Spermienplasmamembran voraus Daher wurde vermutet, dass eine mutmaßliche Bindung porziner Spermien an das Uterusepithel ebenfalls Protein-Kohlenhydrat vermittelt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines Zellkulturmodells aus primären Uterusepithelien der Sau (Sus scrofa), um mögliche Gründe für die hohen Spermienzahlen in der Schweinbesamung zu untersuchen und zu identifizieren. Porzine uterine Epithelien wurden mittels Verdau mit Trypsin/EDTA (1x) gewonnen. Zellen wurden auf Collagen (rat tail, type I) auf Kollagen-beschichteten Deckgläschen aus Glas in 6-Well Kulturschalen ausgesät. Die Anheftung der Zellen an die Kollagen-Matrix wurde nach 12-36 Stunden beobachtet. Erste Kolonien bildeten sich nach fünf bis sieben Tagen und Konfluenz wurde nach zehn bis fünfzehn Tagen erreicht. Der Nachweis der Zellart erfolgte mittels Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Epithelien-spezifischen Antikörper (anti-Cytokeratin-19). Eberspermien banden innerhalb weniger Minuten an die UEC und verblieben währenddessen motil. Eine verringerte Spermienbindung wurde sowohl auf Aortenendothelien als auch fötalen Fibroblasten des Schweins beobachtet. Dies weist auf das Vorhandensein spermienspezifischer Liganden auf den UEC hin. Spermien, wie auch UEC wiesen hohe Bindungsintensitäten für Lektine die an Glc-NAc, (WGA) sowie Gal-NAc (sWGA) binden. Die Sättigung von Sialinsäure führte zu einer stark verminderten Spermienbindung auf den UEC. Bei einer Sättigung von Glc-NAC wurde kein Unterschied beobachtet. Dies kennzeichnet Sialinsäure als den vermutlich wichtigsten Kohlenhydratrest in der Spermien-Epithelzellbindung.