Untersuchungen zu Infektionsverlauf und Ausbildung einer protektiven Immunität im Haushuhn (Gallus gallus) nach in ovo Infektion mit einem pathogenen aviären Paramyxovirusisolat vom Serotyp 1

Alemán. Das klassischerweise beim Wirtschaftsgeflügel gegen das aviäre Paramyxovirus vom Serotyp 1 (APMV-1), den Erreger der anzeigepflichtigen Newcastle Disease, durchgeführte Impfung mit attenuiertem Lebendvirus wird zwischen dem ersten und dem 14. Lebenstag eingesetzt. Es wurden bisher etliche Bemühungen zur Entwicklung einer in ovo Impfung, unternommen, die jedoch nicht zum kommerziellen Einsatz kamen. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, einen im Eintagsküken apathogenen APMV-1 Stamm (APMV-1 599) hinsichtlich seines Infektionsverlaufs und seiner protektiven Wirkung nach Beimpfung in spf-Hühnereiern zu untersuchen. Die Bekämpfung embryonierter Hühnereier am 18. Bebrütungstag mit 106 EID50 des Stammes APMV-1 599 bewirkte eine nahezu vollständige Infektion aller geschlüpften Tiere bei einer Schlupfrate von 81,7% (98 geschlüpfte Tiere aus 120 Eiern). Die Schupfrate einer im selben Brüter geschlüpften uninfizierten Sentinelgruppe betrug 60% (18 Eier aus 30 Eiern), die einer uninfizierten Kontrollgruppe 95% (57 Tiere aus 60 Eiern). Trotz des Erhalts der Schlupfrate zeigten die in ovo APMV-1 infizierten Tiere während der ersten zehn Lebenstage jedoch sehr deutliche klinische Krankheitszeichen in Form respiratorischer Symptome, Apathie, Diarrhoe und in wenigen Fällen zentralnervöser Störungen, die während der ersten acht Lebenstage zu einer Ausfallrate von 54,1 % führten. Im Gegensatz dazu zeigten die zugestellten Sentineltiere trotz nachweislicher Übertragung des Virus durch die Versuchsgruppe nahezu keine klinischen Symptome und virusbedingten Abgänge. Für die Untersuchung der Virusausbreitung wurde zur Erhöhung der Ergebnissicherheit neben einem etablierten Real Time RT-PCR Protokoll, welches einen Abschnitt des Matrixproteins amplifiziert (WISE et al., 2004), ein weiteres Protokoll zur Amplifikation und Detektion eines Abschnitts am 5' Ende des Nukleoproteingens entwickelt. Der Einsatz von sechs konventionellen Nukleotiden der 5' Nukleasesonde durch "locked nucleic acid" (LNA) Nukleotide erlaubte eine Sondenverkürzung von 25 auf 17 Basen. Daraus folgte eine Verbesserung der Sondenbindung an das spezifische Amplifikat, so dass sich die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Protokolls vergleichbar mit der bereits etablierten Methode zeigte. In den in ovo APMV-1 infizierten Küken ließ sich virale RNA während der ersten acht Tage nach dem Schlupf in einer Vielzahl von Organen nachweisen, wobei eine Prädilektion für Lunge und Zäkum / Zäkaltonsille vorlag. Bei zwölf Tieren wurde eine systemische Ausbreitung des Virus mit Nachweis viraler RNA in der Leber, sowie bei neun Tieren im Gehirn beobachtet. Nach Abklingen der klinischen Erkrankung war bei der Probennahme am 14. und 21. Lebenstag kein schwachvirulentes Virus mehr nachzuweisen. Spezifische Antikörper wurden mittels Hämagglutinationshemmungstest ab dem siebten, mittels eines kommerziellen ELISA erst vereinzelt ab dem 21. Lebenstag nachgewiesen. Die Untersuchungen zur zellulären Immunantwort geben zudem Hinweise auf die Ausbildung von T-Memoryzellen. Die durch die einmalige Inokulation in ovo induzierte humorale und zelluläre Immunität war ausreichend, um nach einer Belastungsinfektion mit velogenem Newcastle Disease Virus am 21. Lebenstag aller Tiere der Versuchsgruppe und die meisten Tiere der Sentinelgruppe klinisch zu schützen. Eine Virusausscheidung nach der Belastungsinfektion wurde bei der in ovo infizierten Gruppe nicht festgestellt, während sowohl drei von zehn Tieren der Sentinelgruppe als auch alle Tiere der ungeschützten Kontrollgruppe nach Belastungsinfektion noch Virus ausschieden. Aufgrund der beobachteten Schädigung der Küken ist eine Anwendung des APMV-1 Stammes 599 als in ovo Impfstoff in der angewandten Form auszuschließen. Die Untersuchungen wiesen nach in ovo Beimpfung eine Generalisierung der Infektion und im Vergleich zu der Impfung geschlüpfter Küken eine erhebliche Beeinträchtigung der Tiere nach. Dies deutet auf Entwicklungsprozesse im Embryo während der letzten drei Tage der Brut hin, die entscheidend für die Infektionsabwehr sehr junger Tiere sind. Eine weitere Klärung dieser immunologischen Ereignisse wäre nicht nur für die Entwicklung einer in ovo Impfung für Newcastle Disease sondern auch im Hinblick auf potentielle Frühinfektionen mit anderen Erregern von großer Bedeutung.

Inglés. The vaccination against avian paramyxovirus of the serotype 1 (APMV-1), the highly contagious agent of Newcastle Disease, is usually conducted with live attenuated vaccine strains within the first two weeks after hatch. Multiple efforts have been made to develop an in ovo vaccine, yet none of the approaches proved suitable for an application in commercial poultry. The aim of the performed study was to evaluate the strain APMV-1 599, which had proven apathogenic for day-old chicks, for its progress of infection and the induction of protective immunity after inoculation of spf-chicken eggs. The inoculation of embryonated chicken eggs with 106 EID50 of the APMV-1 599 strain at incubation day 18 caused an infection in virtually all hatched chicks at a maintained hatch rate of 81,7%, which was not substantially lower than that the 60% hatch rate of a group of uninfected sentinel animals that hatched in the same incubator and the hatch rate of 95% of an uninfected and separately hatched control group. Although the hatch rate was not reduced, the animals that were infected in ovo with APMV-1 599 showed pronounced clinical signs during the first ten days after hatch. These manifested themselves in the form of respiratory symptoms, apathy, diarrhea and in sporadic cases central nervous impairments, which led to a mortality rate of 54,1% within the first eight days after hatch. Opposed to this, the affiliated sentinel animals showed neither distinct clinical signs nor a substantially elevated mortality rate despite the proven transmission of the virus by the animals of the in ovo infected goup. To determine the spread of the virus to numerous organs, a novel Real-Time RT-PCR protocol targeting an amplificate located at the 5’ end of the nucleoprotein gene was established in addition to the published and validated method targeting a sequence on the matrix protein gene (WISE et al, 2004). Due to low fluorescence levels and irregular fluorescence curves, six of the conventional nucleotides incorporated into the 5’ nuclease probe were replaced by “locked nucleic acid” (LNA) nucleotides. This led to a shortening of the probe from 25 to 17 bases and thus an improvement of probe hybridization. The newly developed assay showed a comparable performance to the previously established protocol. During the first eight days after hatch, viral RNA was detectable in multiple organs with a predilection for lung and cecum / cecal tonsil. Viral RNA could also be detected in twelve of the liver samples as well as nine of the brain samples. Following the period of clinical impairment, no viral RNA was detectable in the samples from days 14 and 21. Specific antibodies could be detected by hemagglutination inhibition test from day seven and from day 21 by commercial ELISA. Additionally, the evaluation of cellular immune response indicates the formation of t-memory cells in the in ovo infected group and the sentinel animals. One single inoculation of APMV-1 599 in ovo was sufficient to induce a humoral and cellular immune response to protect all in ovo infected and most of the sentinel animals upon challenge with velogenic NDV Herts (Weybridge 33 / 56) at day 21. Shedding of the challenge virus was not noted in the in ovo infected group, while three of the ten sampled sentinel animals as well as all the animals in the control group shed virus two and four days after challenge, respectively. Due to the visible clinical impairment of the chicks, an in ovo vaccination with APMV-1 599 in the applied mode is not to be considered. The performed experiments demonstrated a generalization of the infection and servere clinical symptoms compared to the vaccination of animals after hatch. These results are indicative of embryonic developmental processes within the last three days before hatch, which are essential for the immunologic defense of very young chicks. A complete understanding of these ongoing immunological processes would not only be of importance for the development of in ovo vaccines against Newcastle Disease, but also in regard to potential early infections with other infectious agents.