Functional analyses of porcine T-cell responses upon viral infections | Funktionelle Analysen porziner T-Zell-Antworten bei viralen Infektionen –Erkenntnisse aus Schweinen als natürliche Wirte und biomedizinische Modelle

Alemán. Virale Erkrankungen sind eine Bedrohung für Bakterien und große Tiere gleichermaßen. Gegen mehrere Viren sind Impfstoffe verfügbar. Für einige Viren, wie ASFV, gibt es jedoch noch immer keine Impfstoffe, während sie für andere, wie IAV, nicht so wirksam sind, wie wir sie brauchen. Das liegt zu einem großen Teil daran, dass wir die Mechanismen, die antivirale Immunität verleihen, nicht vollständig verstehen. Um unser Verständnis der antiviralen Immunität zu verbessern, haben wir eine Modellspezies verwendet, die in vielen immunologischen Aspekten dem Menschen näher ist als die weit verbreiteten Labormäuse, nämlich Schweine. In dieser Arbeit wurden Schweine als potentielle biomedizinische Modellspezies für virale Atemwegsinfektionen beim Menschen und als natürlicher Wirt für virale Infektionen untersucht. Beide Ansätze liefern wertvolle Einblicke in Aspekte der Immunologie des Schweins, die entweder als Grundlage für die translationale Forschung oder für das Design von gezielten Therapeutika und Impfstoffen für Schweine genutzt werden können. Einblicke in grundlegende Eigenschaften des Immunsystems von Schweinen bilden die Grundlage für translationale Studien. Paper I leistete Pionierarbeit bei der detaillierten Charakterisierung porziner iNKT-Zellen. Um Schweine und porzine iNKT-Zellen für wissenschaftliche Untersuchungen zugänglicher zu machen, haben wir Multicolor-Durchflusszytometrie-Analyseplattformen etabliert, die eine detailliertere Untersuchung dieser Zellen als bisher möglich machen. Wir konnten zeigen, dass die im peripheren Blut zirkulierenden porzinen iNKT-Zellen eine seltene Population unter den CD3+ Lymphozyten sind, die einen voraktivierten Effektorstatus aufweist und in mindestens drei funktionelle Untergruppen unterteilt werden kann. Nach antigener Aktivierung proliferieren sie schnell, sezernieren pro-inflammatorische Zytokine und üben Zytotoxizität aus. Darüber hinaus lieferten wir erste Hinweise für eine Rolle von iNKT-Zellen bei IAV- und ASFV-Infektionen bei Schweinen, die wir in Paper IV genauer untersucht haben. Zentrale Charakteristika, d.h. Phänotyp und funktionelle Eigenschaften, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit zwischen Mensch und Schwein auf. Darüber hinaus sind die Unterschiede zwischen menschlichen und murinen iNKT-Zellen stärker ausgeprägt als zwischen Mensch und Schwein. Basierend auf den in Paper II erzielten Ergebnissen könnte das etablierte biomedizinische Modell für weitere Studien zu infektiösen Atemwegserkrankungen verwendet werden. IAV-Infektionen ebnen den Weg für sekundäre Ko-Infektionen mit erhöhter Morbidität und Letalität. Diese baktoviralen Ko-Infektionen stellen eine Bedrohung sowohl für Schweine als auch für Menschen dar. Die gemeinsame Anfälligkeit sowie Homologien auf physiologischer und immunologischer Ebene machen das Schwein zu einem außerordentlich geeigneten Tiermodell für Untersuchungen dieser Infektionen. Paper I und II können auch unter translationalen Aspekten interpretiert werden. Die Aktivierung von iNKT-Zellen in Impfstudien am Schwein zeigte vielversprechende Ergebnisse. Basierend auf diesen und unseren Ergebnissen könnte dies ein geeigneter Ansatz auch für den Menschen sein. Zusammen mit anderen Studien legen unsere Ergebnisse nahe, dass Schweine ein gut geeignetes Großtiermodell für die Erforschung von Infektionskrankheiten sein könnten. Dies gilt insbesondere für Atemwegsinfektionen, wie z. B. saisonale IAV-Infektionen, für die Schweine natürliche Wirte sind und als "Mischgefäße" zur viralen Ausbreitung und Entstehung beitragen, was zu pandemischen Stämmen wie H1N1pdm09 führen kann. Wir konnten zeigen, dass porzine iNKT-Zellen sowie die antiviralen Antworten von cTC gegen H1N1pdm09 in Schweinen vergleichbar mit menschlichen Zellen und Prozessen sind. Der verstärkte Einsatz von Schweinen in der Grundlagen- und angewandten Forschung könnte eine verbesserte Translation der wissenschaftlichen Erkenntnisse in die Human- und Veterinärmedizin ermöglichen. In zwei weiteren Studien, Paper III und IV, untersuchten wir T-Zell-Antworten während einer Virusinfektion, der ASP, für die Schweine die einzigen natürlichen Wirte sind. Die Immunantworten waren nach hoch- und mäßig virulenter ASFV-Infektion bei Haus- und Wildschweinen ähnlich. Sie unterschieden sich jedoch zwischen den beiden Spezies. Die antivirale Immunität bei Hausschweinen wurde überwiegend von αβ T-Zellen, CD8α+ und DP αβ T-Zellen, ausgeübt, während die Reaktion bei Wildschweinen von γδ T-Zellen, hauptsächlich CD8α+ Effektorzellen, dominiert wurde. Da Wildschweine auch bei einer Infektion mit dem mäßig virulenten ASFV "Estonia2014" eine höhere Krankheitsschwere und Letalität zeigen, scheint eine Verschiebung zu γδ T-Zellen nachteilig zu sein. Im Gegensatz dazu überleben Hausschweine Infektionen mit mäßig virulentem ASFV "Estonia2014", was darauf hindeutet, dass CD8α+ oder DP αβ T-Zellen zumindest bei Infektionen mit nicht-hochvirulenten ASFV-Stämmen Schutz verleihen. Interessanterweise fanden wir in Paper V eine höhere und länger anhaltende Entzündung bei Hausschweinen, die mit einem erhöhten T-Zell-Einstrom korrelierte. Histopathologische Analysen ergaben jedoch keine direkte Erklärung für die Unterschiede im Krankheitsverlauf und der Letalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Diese Ergebnisse erfordern weitere Studien, um die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Das Fehlen grundlegender Daten über immunologische Unterschiede zwischen Hausschweinen und Wildschweinen erschwert die Versuche, die Immunität gegen ASFV zu verstehen. Wir fanden Unterschiede zwischen beiden Wildschwein-Unterarten bereits im Steady-State und noch deutlicher während ASFV-Infektionen in Papers III-V. Offenbar waren die T-Zell-Antworten beim Wildschwein stark auf γδ T-Zellen ausgerichtet, während die Immunantwort beim Hausschwein auf αβ T-Zellen basierte. Es fehlen jedoch Informationen über selbst grundlegende Eigenschaften, wie die Zusammensetzung, Phänotypen und funktionellen Qualitäten des Immunsystems von Wildschweinen. Daher müssen wesentliche Ausgangsdaten gewonnen werden, um Veränderungen in zukünftigen Studien adäquat bewerten zu können. Analysen wie diese offenbaren wesentliche Vorteile des Schweins als biomedizinisches Modell. Zum einen können Forscher, ähnlich wie bei herkömmlichen Modellspezies, jedes Gewebe zu jedem gewünschten Zeitpunkt untersuchen. Gewebe von menschlichen Patienten ist oft nur spärlich oder gar nicht verfügbar, so dass Modelle benötigt werden, die zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion untersucht werden können. Andererseits sind die an Schweinen gewonnenen Ergebnisse besser mit dem Menschen vergleichbar als Daten aus Studien an Mäusen. Außerdem sind Schweine für ähnliche Erreger wie Menschen empfänglich und experimentelle Infektionen können ohne größere genetische Manipulationen untersucht werden. Allerdings gibt es auch Einschränkungen des Schweinemodells. Die Analysewerkzeuge sind eingeschränkter verfügbar als bei Mäusen, insbesondere was die Verfügbarkeit von mAbs oder genetisch veränderten Organismen betrifft. Dennoch sollten angesichts der großen und immer deutlicher werdenden Vorteile Anstrengungen unternommen werden, um Schweine für die Grundlagen- und translationale Forschung besser einsetzbar zu machen. Darüber hinaus können an Schweinen gewonnene Erkenntnisse auch für die Spezies selbst genutzt werden. Schweine sind eine wichtige Nutztierart und neue Behandlungen oder Impfstoffe könnten auch für sie verwendet werden. Daher könnte diese Forschung letztendlich auch zum Tierschutz beitragen. Zusammenfassend hat die vorliegende Arbeit das Wissen über die Immunprozesse von Schweinen für cTC im Allgemeinen und iNKT-Zellen im Besonderen deutlich erweitert. Die Ergebnisse wurden sowohl im Steady-State als auch im Kontext von IAV- und ASFV-Infektionen gewonnen und machen somit das Schwein als Modell für zukünftige Forschung besser verfügbar. Der Einsatz der multiparamterischen Durchflusszytometrie lieferte einen breiten Überblick über die ablaufenden Immunreaktionen und ermöglicht weitere, weitreichendere Studien, die auch offene Fragen in noch komplexeren Infektionsszenarien adressieren können.

Inglés. Viral diseases are a threat to bacteria and enormous animals alike. Vaccines are available against several viruses. However, for some viruses, like ASFV, we still lack vaccines, while for others, like IAV, they are not as effective as we need them to be. To a large extent, this is because we do not fully understand the mechanisms conferring antiviral immunity. To improve our understanding of antiviral immunity, we used a model species that is in many immunological aspects closer to humans than the widely used laboratory mice, pigs. In this thesis, pigs were investigated as a potential biomedical model species for viral respiratory infections in humans and as a natural host for viral infections. Both approaches provide valuable insights into aspects of porcine immunology that can either be used as the foundation for translational research or for the design of targeted therapeutics and vaccines for pigs. Insights into fundamental characteristics of the porcine immune system form the basis for translational studies. Paper I pioneered a detailed characterization of porcine iNKT cells. To make pigs and porcine iNKT cells more available for scientific investigations, we established multicolor flow cytometry analysis platforms that allow for a more detailed investigation of these cells than previously possible. We found porcine iNKT cells circulating in peripheral blood to be a rare population among CD3+ lymphocytes that displays a pre-activated effector state and can be divided into at least three functional subsets. Upon antigenic activation, they proliferated rapidly, secreted pro-inflammatory cytokines, and exerted cytotoxicity. Moreover, we provided first evidence for a role of iNKT cells in porcine IAV and ASFV infections, which we investigated in more detail in paper IV. Central characteristics, i.e., phenotype and functional properties, exhibit a high degree of similarity between humans and pigs. Moreover, differences between human and murine iNKT cells are more pronounced than between humans and pigs. Based on the results obtained in paper II, the established biomedical model could be used for further studies of infectious respiratory diseases. IAV infections pave the way for secondary co-infections with increased morbidity and lethality. These bactoviral co-infections are a threat to both pigs and humans. The shared susceptibility as well as homologies on the physiological and immunological level make pigs exceptionally suitable animal models for studies of these infections. Paper I and II can also be interpreted under translational aspects. Activation of iNKT cells in porcine vaccination studies showed promising results. Based on these and our findings, this might be a suitable approach for humans as well. Along with other studies, our results suggest that pigs might be a well-suited large animal model for research in infectious diseases. This is true especially for respiratory infections, such as seasonal IAV infections, for which pigs are natural hosts and contribute to viral spread and emergence as “mixing vessels”, which can result in pandemic strains like H1N1pdm09. We could show that porcine iNKT cells as well as the antiviral responses of cTC against H1N1pdm09 in pigs are comparable to human cells and processes. The increased implementation of pigs in basic and applied research might enable an improved translation of scientific knowledge to human and veterinary medicine. In two further studies, papers III and IV, we investigated T-cell responses during a viral infection, ASF, for which pigs are the only natural hosts. Immune responses were similar after highly and moderately virulent ASFV infection in domestic pigs and wild boar, respectively. However, they differed between both species. Antiviral immunity in domestic pigs was predominantly exerted by αβ T cells, CD8α+ and DP αβ T cells, while the response in wild boar was dominated by γδ T cells, mainly CD8α+ effector cells. Since wild boar show a higher disease severity and lethality, even during infection with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, a shift to γδ T cells seems to be detrimental. In contrast, domestic pigs survive infections with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, which indicates that CD8α+ or DP αβ T cells confer protection at least in infections with non-highly virulent ASFV strains. Interestingly, in paper V we found higher and prolonged inflammation in domestic pigs, correlating with increased T-cell influx. However, histopathological analyses revealed no direct explanation for the differences in disease progression and lethality in domestic pigs and wild boar. These findings require further studies to elucidate the underlying mechanisms. The lack of basic data about immunological differences between domestic pigs and wild boar hampers attempts to understand immunity against ASFV. We found differences between both suid subspecies already at steady state and even more prominent during ASFV infections in papers III-V. Most apparently, T-cell responses in wild boar were heavily biased towards γδ T cells, while immune responses in domestic pigs were based on αβ T cells. However, information about even basic characteristics, like the composition, phenotypes, and functional qualities of wild boar’s immune system, is missing. Therefore, essential baseline data must be obtained in order to adequately assess changes in future studies. Analyses like these reveal major advantages of pigs as a biomedical model. On the one hand, similar to conventional model species, researchers can investigate every tissue at any desired time. Tissue from human patients is often scarce or not at all available, so models that can be investigated at specific times after infection are needed. On the other hand, results obtained in pigs are more comparable to humans than data from murine studies. Moreover, pigs are susceptible to similar pathogens as humans and experimental infections can be investigated without the need for major genetic manipulations. However, there are also limitations of the porcine model system. Analysis tools are not as advanced as they are for mice, especially in terms of availability of mAbs or genetically modified organisms. Still, given the major advantages that become more and more obvious, efforts should be made to make pigs more applicable for basic and translational research. In addition, findings derived from pigs can be used for the species itself. Pigs are a major livestock species and new treatments, or vaccines could also be used for them. Therefore, this research could eventually also improve animal welfare. In summary, the presented thesis significantly enhanced our knowledge of porcine immune processes for cTC in general and iNKT cells in particular. Results were obtained both at steady state and in the context of IAV and ASFV infections, and thus, made pigs more available as a model for future research. The use of multicolor flow cytometry provided a broad overview of the ongoing immune reactions and enables further, more wide-ranging studies that can also address open questions in even more complex infection scenarios.