Natural phenolic compounds - gut microbiota dynamics: a mutual relationship | Dinâmica compostos fenólicos naturais - microbiota intestinal: uma relação mútua

Phenolic compounds (PCs) represent one of the most structurally diverse classes of plant secondary metabolites, with more than 10,000 different structures identified in nature. These bioactive compounds are widely distributed and commonly found in the human diet, particularly in vegetables and fruits. With several recognized biological activities (such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, anti-microbial among others), their presence in dietary products has been correlated with multiple beneficial effects on human health. However, the biological activities of dietary PCs are affected by several factors, including chemical structure, content in the human diet and bioavailability. The behavior of these compounds along the gastrointestinal tract appears to be crucial for their human health effects, as PCs may undergo various transformations induced by gastrointestinal enzymes or gut microbiota (GM), into lower molecular weight compounds. Conversely, GM community, which plays a pivotal role in human health, and its composition is influenced by a number of different factors (e.g. age, gender, diet, the use of drugs and environmental factors), can be modulated by dietary PCs. These compounds have the potential to inhibit or stimulate specific intestinal bacteria - both beneficial and/or pathogenic ones - acting as prebiotic and/or antibacterial agents. Therefore, this mutual relationship between PCs and GM has been widely studied by the scientific community. However, most of these studies have employed food matrices, which impede a comprehensive understanding of the metabolites resulting from each of the PCs present in such matrices, and the individual modulatory effect on GM. Hence, the objective of this thesis was to study the mutual relationship between individual dietary PCs and GM. Initially, a total of 2,921 indexed scientific articles were analyzed to achieve a comprehensive understanding of the structure-activity relationship (SAR) between PCs and their antioxidant activity, with the compilation of results from approximately 350 articles. The presence of OH groups demonstrated a predominant positive influence on antioxidant activity of most PCs classes, whereas their substitution exhibited a negative effect. Subsequently, the bioaccessibility and intestinal absorption of ten PCs representative of the major classes, namely quercetin, rutin, naringenin, naringin, epigallocatechin-gallate, apigenin, daidzein, phloretin, phloroglucinol and ellagic acid were evaluated in an in vitro simulated gastrointestinal digestion (INFOGEST), and the collected samples were analyzed by ultra-high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detection and tandem mass spectrometry (UHPLC-DAD-MSn). Most of the studied PCs were found along the gastrointestinal tract, exhibiting no enzymatic transformations and bioaccessibilities above 50%. They showed highly levels of absorption under simulated intestine conditions. In light of the results obtained in the previous works, the lack of information in literature on microbiota modulation, and the previously determined antimicrobial and prebiotic properties of certain compounds, three phenolic compounds (ellagic acid (EA), naringenin (NAR) and phloroglucinol (PG)) were individually subjected to an in vitro batch fecal fermentation, in order to identify the metabolites produced by GM and also to ascertain the modulatory effect of these PCs and their respective metabolites on the GM community composition. Through UHPLC-DAD-MSn analysis, 8-hydroxyurolithin was identified for the first time as an EA metabolite produced by GM and isomers of 4-hydroxybenzoic, 3,4-dihydroxybenozic and p-coumaric acids as NAR metabolites. The lower molecular weight metabolites of PG were detected by UHPLC-DAD-MSn and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) analysis, being identified for the first time phloroglucinic, 2-hydroxy-3-phenylpropanoic, 3-phenylpropanoic and 2-phenylacetic acids. Regarding their impact on the composition of GM, EA and PG demonstrated prebiotic properties, promoting the growth of beneficial Lactobacillus and Bifidobacterium genera, and stimulating the production of health-promoting specific short-chain fatty acids (SCFAs) (such as acetic, propionic and butyric acids). In contrast, NAR seemed to stimulate the growth of potentially pathogenic genera, including Escherichia and Salmonella. Furthermore, to comprehend the impact of these PCs’ metabolism on their biological activities, the antioxidant activity of EA, NAR and PG and their respective metabolites antioxidant activity was evaluated through two in chemico assay (DPPH and ABTS). The complete transformation of EA appeared to result in a reduction in antioxidant activity, whereas some of the NAR metabolites seemed to have a higher antioxidant activity than the precursor compound. With regard to PG and the most active metabolite phloroglucinic acid, it was not possible to establish a SAR between the two compounds, due to the lack of agreement in the results obtained from the DPPH and ABTS assays. In this vein, the results presented in this thesis contribute to the understanding of the potential beneficial effects of dietary PCs on human health. Additionally, these findings may represent a significant contribution for developing food supplements, novel prebiotics or functional foods. In the future, this knowledge could be used to evaluate the combination of PCs in order to create a more diverse and well-balanced GM ecosystem. Furthermore, when combined with emerging methodologies for drug delivery or bioactive compound encapsulation, this knowledge may prove instrumental in developing new nutraceutical and pharmaceutical formulations, as well as personalized nutrition strategies based on microbiota profiling, which could advance the control and/or prevention of certain diseases.

Os compostos fenólicos (CFs) constituem uma das classes de metabolitos secundários das plantas mais estruturalmente diversas, com mais de 10,000 estruturas diferentes identificadas na natureza. Estes compostos bioativos estão amplamente distribuídos e são frequentemente encontrados na dieta humana, particularmente em vegetais e frutas. Com várias atividades biológicas reconhecidas, como antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena e antimicrobiana, a sua presença em produtos alimentares tem sido correlacionada com múltiplos efeitos benéficos para a saúde humana. No entanto, as atividades biológicas dos CFs dietéticos são influenciadas por diversos fatores, incluindo a estrutura química, o conteúdo na dieta humana e a biodisponibilidade. O comportamento destes compostos ao longo do trato gastrointestinal é crucial, uma vez que os CFs podem sofrer várias transformações induzidas por enzimas gastrointestinais ou pela microbiota intestinal (MI), resultando em metabolitos de menor peso molecular. Por outro lado, a comunidade da MI, que desempenha um papel fundamental na saúde humana; é influenciada por diversos fatores, como a idade, o género, a dieta, o uso de medicamentos e fatores ambientais, e pode ser modulada pelos CFs dietéticos. Estes compostos têm o potencial de inibir ou estimular bactérias intestinais especificas – tanto benéficas como patogénicas - agindo como agentes prebióticos e/ou antimicrobianos. Portanto, a relação mútua entre os CFs e a MI tem sido amplamente estudada pela comunidade científica. No entanto, a maioria destes estudos utilizou matrizes alimentares, o que dificulta uma compreensão abrangente dos metabolitos resultantes de cada um dos CFs presentes nessas matrizes e do efeito modulatório individual sobre a MI. Assim, o objetivo desta tese foi estudar a relação mútua entre os CFs dietéticos individuais e a MI. Inicialmente, foi realizada uma análise de 2,921 artigos científicos indexados para alcançar uma compreensão abrangente da relação estrutura-atividade dos CFs e a sua atividade antioxidante, compilando resultados de aproximadamente 350 artigos. A presença de grupos OH demonstrou uma influência positiva predominante na atividade antioxidante da maioria das classes de CFs, enquanto a sua substituição teve um efeito negativo. Subsequentemente, a bioacessibilidade e a absorção intestinal de dez CFs representativos das principais classes - nomeadamente quercetina, rutina, naringenina, naringina, epigalocatequina-galato, apigenina, daidzeína, floretina, floroglucinol e ácido elágico - foram avaliadas numa digestão gastrointestinal simulada in vitro (INFOGEST), e as amostras recolhidas foram analisadas por cromatografia líquida de alta resolução acoplada a detetor de varrimento de díodos e espectrometria de massa (UHPLC-DAD-MSn). A maioria dos CFs estudados foi encontrada ao longo do trato gastrointestinal sem apresentar transformações enzimáticas, com bioacessibilidade superiores a 50%. Foi verificada ainda uma absorção elevada na simulação do ambiente intestinal. Tendo em conta os resultados obtidos nos trabalhos anteriores e a escassez de informação na literatura sobre a modulação da microbiota, bem como as propriedades antimicrobianas e prebióticas previamente determinadas de certos compostos, três dos CFs (ácido elágico, naringenina, floroglucinol) foram submetidos individualmente a uma fermentação fecal em in vitro, com o objetivo de identificar os metabolitos produzidas pela MI e determinar o efeito modulatório destes CFs e dos seus respetivos metabolitos na composição da comunidade de MI. Através da análise UHPLC-DAD-MSn, foi identificada pela primeira vez a 8-hidroxiurolitina como um metabolito do ácido elágico produzido pela MI, assim como isómeros dos ácidos 4-hidroxibenzóico, 3,4-dihidroxibenzóico e p-cumárico como metabolitos da naringenina. Os metabolitos de menor peso molecular do floroglucinol foram detetados por UHPLC-DAD-MSn e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS), identificando pela primeira vez os ácidos floroglucínico, 2-hidroxi-3-fenilpropanóico, 3-fenilpropanóico e 2-fenilacético. Relativamente ao impacto na composição da MI, foi evidenciado que o ácido elágico e o floroglucinol demonstraram propriedades prebióticas, promovendo o crescimento dos géneros benéficos, como Lactobacillus e o Bifidobacterium, e estimulando a produção de ácidos gordos de cadeia curta benéficos para a saúde, como os ácidos acético, propiónico e butírico. Em contraste, a naringenina pareceu estimular o crescimento de géneros potencialmente patogénicos, incluindo Escherichia e Salmonella. Além disso, para compreender o impacto do metabolismo destes CFs nas suas atividades biológicas, a atividade antioxidante do ácido elágico, da naringenina, do floroglucinol, bem como dos seus respetivos metabolitos, foi avaliada através de dois ensaios in chemico (DPPH e ABTS). A transformação completa do ácido elágico resultou numa redução da atividade antioxidante, enquanto alguns dos metabolitos da naringenina pareceram ter uma atividade antioxidante superior ao composto precursor. Relativamente ao floroglucinol e ao seu metabolito mais bioativo, o ácido floroglucínico, não foi possível estabelecer uma relação estrutura-atividade entre estes dois compostos, devido à falta de concordância nos resultados obtidos nos ensaios DPPH e ABTS. Neste contexto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para a compreensão dos potenciais efeitos benéficos dos CFs dietéticos na saúde humana. Além disso, estas evidencias podem representar uma contribuição significativa para o desenvolvimento de suplementos alimentares, novos prebióticos ou alimentos funcionais. Futuramente, este conhecimento poderá ser utilizado para avaliar a combinação de CFs de modo a criar um ecossistema de MI mais diversificado e equilibrado. Para além disso, quando combinados com metodologias emergentes de libertação controlada de fármacos ou encapsulamento de compostos bioativos, este conhecimento poderá ser útil no desenvolvimento de novas formulações nutracêuticas e farmacêuticas, bem como em estratégias de nutrição personalizada baseada no perfil da MI, que podem avançar no controlo e/ou prevenção de certas doenças.

Programa Doutoral em Biotecnologia