Isolamento e caracterização imunológica de roptrias de Neospora caninum | Isolation and immunological characterization of rhoptries from Neospora caninum

Portugués. Neospora caninum é um parasita que causa perdas consideráveis na pecuária bovina. Compreender os seus mecanismos de infecção é essencial para compreender o seu impacto nos rebanhos. O fracionamento celular e a caracterização das frações poderão contribuir para a seleção de proteínas e organelas com características imunogênicas. Assim, o presente estudo teve como objetivo isolar frações roptrias e subcelulares de N. caninum utilizando gradiente de sacarose e caracterizar sua imunogenicidade em camundongos. Taquizoítos da cepa Nc-1 foram cultivados em células VERO, fracionados por esferas de vidro e ultracentrifugados em gradiente de sacarose variando de 0,25 a 1,8 M. As frações foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão. Cada fração foi inoculada com adjuvante Quil-A (20 μg) em camundongos para produzir anticorpos policlonais para cultura de células de imunofluorescência e western blotting. A ultracentrifugação resultou em três frações distintas (F1, F2 e F3) e um pellet. A fração um (F1) na concentração de 1,0 M continha membranas do parasita, F2 a 1,4 M continha roptria e conoide, F3 a 1,6 M continha mitocôndrias e o sedimento na fração de 1,8 M continha restos celulares. As quatro frações exibiram as mesmas bandas com pesos moleculares de 50, 51, 52 e 62 kDa. Apenas F2 apresentou estruturas de roptria e uma proteína de 54 kDa semelhante a NcROP2. Este estudo separou com sucesso frações subcelulares de N. caninum através de processamento e ultracentrifugação, identificou estruturas de roptria e determinou pesos específicos de proteínas de cada fração.

Inglés. Neospora caninum is a parasite that causes considerable loss in cattle production. Understanding its infection mechanisms is essential to comprehend its impact on herds. Cell fractionation and characterization of the fractions could contribute to the selection of proteins and organelles with immunogenic characteristics. Thus, the present study aimed to isolate rhoptry and subcellular fractions of N. caninum using a sucrose gradient and characterize their immunogenicity in mice. Tachyzoites of the Nc-1 strain were cultured in VERO cells, fractionated by glass beads, and ultracentrifuged in a sucrose gradient ranging from 0.25–1.8 M. The fractions were characterized using transmission electron microscopy. Each fraction was inoculated with Quil-A adjuvant (20 μg) into mice to produce polyclonal antibodies for immunofluorescence cell culture and Western blotting. Ultracentrifugation resulted in three distinct fractions (F1, F2, and F3) and a pellet. Fraction one (F1) at 1.0 M concentration contained parasite membranes, F2 at 1.4 M contained rhoptry and conoid, F3 at 1.6 M contained mitochondria, and the pellet at 1.8 M fraction contained cell debris. The four fractions exhibited the same bands with molecular weights of 50, 51, 52, and 62 kDa. Only F2 showed rhoptry structures and a 54 kDa protein resembling NcROP2. This study successfully separated subcellular fractions of N. caninum through processing and ultracentrifugation, identified rhoptry structures, and determined specific protein weights of each fraction.