El incremento en severidad de las epidemias de Verticilosis del olivo (VO) ha ocurrido de manera paralela a la implantación del riego en nuevas plantaciones y en plantaciones de olivar tradicional en Andalucía. El agua de riego puede influir sobre la VO por actuar como vehículo de dispersión de los propágulos de Verticillium dahliae. Por todo ello, los objetivos planteados en esta investigación han consistido en determinar y cuantificar la presencia de V. dahliae en el agua utilizada para el riego de olivares en Andalucía, y estudiar la evolución temporal de los niveles de dichos propágulos durante la temporada de riego. Se han prospectado un total de 33 campos de olivo afectados por la Verticilosis en las provincias de Jaén y Sevilla en los años 2004 (5 y 18, respectivamente) y 2005 (7 y 14, respectivamente), siendo 11 de los campos comunes en ambos años de muestreo. En cada campo, se analizaron 2-8 muestras de 0,5 L de agua de riego obtenidas desde marzo hasta julio del año 2004, y 3-4 muestras de 1000 L de agua recolectadas desde febrero hasta abril del año 2005. V. dahliae se aisló sólo de las muestras de agua analizadas en el año 2005. El patógeno se recuperó del agua de riego del 85,7% de los campos prospectados en cada provincia, que representaron el 87,5 y 80% del total de campos regados con agua de pozo y agua superficial embalsada de origen en el río Guadalquivir, respectivamente. Independientemente de su origen, el agua de riego de ambas provincias estuvo infestada por propágulos de V. dahliae que, según su tamaño, se diferenciaron en esclerocios (>/= 20 micro m) y micropropágulos (<20 y >/= 1,2 micro m). Los micropropágulos se recuperaron del agua de riego de un porcentaje mayor de campos que utilizaron agua infestada (78%) y en mayores cantidades promedio (3158,9 micropropágulos/1000 L) que los esclerocios (44% y 1,5 esclerocios/1000 L, respectivamente). Entre los campos que emplearon para regar agua infestada por V. dahliae, la incidencia de campos con agua contaminada por esclerocios varió de 0 a 33% durante la temporada de riego y no siguió un patrón temporal reconocible, mientras que el porcentaje de campos con agua infestada por micropropágulos alcanzó un máximo de 33% en Jaén y 75% en Sevilla en la segunda y primera quincena de Marzo, respectivamente, y disminuyó progresivamente durante los muestreos de primavera. | The increment in severity of Verticillium wilt epidemics of olive trees has been associated with the establishment of irrigation in new and traditional olive orchards in Andalucía. Irrigation water can influence Verticillium wilt of olive (VO) by means of the dispersal of propagules of Verticillium dahliae. Therefore, the objectives of this research work were to determine and quantify the presence of V. dahliae in the irrigation water used in olive orchards in Andalucía, and to study the variation in the level of the pathogen populations over time during the irrigation season. Disease surveys were carried out in 33 olive orchards affected by Verticillium wilt at the Jaén and Sevilla provinces in 2004 (5 and 18 fields, respectively) and 2005 (7 and 14 fields, respectively), with 11 of the fields being prospected in both years. In each field, 2-8 irrigation water samples of 0.5 L obtained from March to July in 2004 and 3-4 samples of 1000 L of water collected from February to April in 2005 were analysed. V. dahliae was isolated only of the water samples analysed in 2005. The pathogen was recovered of irrigation water in 85.7% of the olive orchards surveyed in each province, representing 87.5 and 80% of total of fields irrigated with subterranean water from wells and dammed up superficial water from the Guadalquivir river, respectively. Subterranean and superficial irrigation water in both provinces were infested by propagules of V. dahliae, which were differentiated because of their size in sclerotia (>/= 20 micro m) and micropropagules (<20 y >/= 1.2 micro m). The micropropagules were recovered from irrigation water in a higher percentage of fields that used infested water (78%) and in higher average levels (3158,9 micropropagules/1000 L) than sclerotia were (44% y 1,5 sclerotia/1000 L, respectively). Within the olive orchards irrigated with water infested by V. dahliae, the incidence of fields with water contaminated by sclerotia varied from 0 to 33% through the irrigation season and did not show any recognizable pattern over time, while the percentage of fields with water infested by micropropagules reached a maximum of 33% in Jaén and of 75% in Sevilla in the second and first fortnight of March, respectively, and decreased progressively through the spring samplings.

La contaminación de las aguas de riego por Verticillium dahliae supone un riesgo para la sanidad de cultivos susceptibles al patógeno en Andalucía. La dispersión de conidias y esclerocios del patotipo defoliante del hongo a través de este medio, ha contribuido a la extensión y el desarrollo de las epidemias de Verticilosis del olivo (VO) en esta región. La aplicación de desinfectantes químicos al agua de riego puede suprimir la infestación por conidias de V. dahliae, y podría constituir una medida de exclusión dentro del manejo integrado de la VO si se probara también su eficacia frente a esclerocios, estructuras de supervivencia del hongo. Además, dado que el destino final del agua tratada sería la zona de influencia del sistema radicular, esta práctica podría contribuir a erradicar al hongo en el suelo y/o reducir la enfermedad en olivares infestados. El primer objetivo de esta tesis consistió en evaluar in vitro la eficacia de la desinfestación química para prevenir y erradicar infestaciones del agua por esclerocios de V. dahliae. Tres productos de diferente composición (OX-VIRIN®, OX-AGUA AL25® y Deccoklor®) fueron evaluados en función de la concentración, el aislado de V. dahliae y el tiempo de acción. El efecto de los productos OX-VIRIN® (OV) y OX-AGUA AL25® (OA), ambos conteniendo peróxido de hidrógeno en su formulación, varió con la concentración y tiempo de acción. La eficacia supresiva en los días posteriores al tratamiento del agua infestada (5-30 días) fue de 87,8-100% para las tres concentraciones más altas de OV (3,2-51,2 mL L-1) y de 99,6-100% para las dos más altas de OA (0,4175 y 1,2525 mL L-1). Estas concentraciones de OV mostraron mayor eficacia preventiva que las de OA frente a infestaciones realizadas 30 días después del tratamiento químico del agua (97-100% vs. 68,9-100%). El producto clorado Deccoklor® no fue eficaz. La eficacia potencial de los desinfectantes OV y OA para reducir al hongo en el suelo y la VO se evaluó en plantas jóvenes bajo ambiente controlado en varios experimentos. El efecto fitotóxico de las aplicaciones de los desinfectantes al suelo se exploró también sobre la planta. Cultivares de olivo susceptibles Picual y Arbequina fueron crecidos en suelo infestado con V. dahliae y sometidos a diferentes tratamientos desinfestantes con agua tratada a 3,2 mL L−1 de OV o a 0,4175 mL L−1 de OA, concentraciones mínimas recomendables para la desinfestación de agua según los resultados del primer objetivo. Las aplicaciones semanal y mensual de OV y la quincenal de OA redujeron sólidamente la densidad de inóculo total y de esclerocios del hongo en el suelo en hasta un 21,3-29,6% y 65,6-91,2%, respectivamente, dependiendo del tratamiento. Estas mismas aplicaciones redujeron la enfermedad entre un 0- 40,2% y 3-61,4%, según el parámetro evaluado, en los cultivares Picual y Arbequina, respectivamente. Los tratamientos evaluados no afectaron negativamente al crecimiento de los plantones ni se identificó indicio alguno de fitotoxicidad en ambos cultivares. Los sistemas de riego del olivar andaluz permiten el tratamiento del agua embalsada, pero también en la red de distribución mediante bombas de inyección. La tercera parte de la tesis abordó la eficacia de inyectar desinfectantes en el sistema de riego para reducir la incorporación y acumulación de V. dahliae en el suelo en función de la concentración de los productos (OV y OA; 3,2-51,2 mL L-1 y 1,25-11,27 mL L-1, respectivamente), el tipo de propágulo del hongo presente en el agua (conidias o esclerocios), y las condiciones ambientales (primavera u otoño). La inyección de OV y OA previno o redujo en más de un 95% la acumulación de conidias y esclerocios en el suelo en ambas estaciones según la concentración aplicada. La enfermedad no fue observada y la infección fue prevenida o marcadamente reducida en plantones de olivo crecidos en el suelo regado con agua infestada y tratada. El último objetivo de la tesis fue evaluar la eficacia de la inyección de los desinfectantes en la red de riego para reducir la densidad de inóculo del hongo en el suelo y la VO bajo condiciones de ambiente natural en un experimento de larga duración. Se combinó el cultivar Picual, un aislado defoliante altamente virulento de V. dahliae, y diferentes estrategias de aplicación de OV (3,2 mL L-1) y OA (3,76 mL L-1) durante dos periodos comprendiendo desde final de invierno a final de verano. La desinfestación redujo la densidad de inóculo total en el suelo (51,2% de media) y la incidencia de enfermedad e infección (20,0% y 18,4% de media, respectivamente). La aplicación quincenal de OA fue la estrategia que arrojó mejores resultados en términos de reducción de inóculo total (75%) y esclerocios (85,4%) en el suelo, y reducción de síntomas (53%) e infección (70,8%) en olivo. La desinfestación, especialmente bajo la estrategia anterior, atenuó el impacto negativo de la infección sobre el crecimiento y la producción al promover la recuperación de la enfermedad. Los desinfectantes testados no solo reducen los esclerocios en el agua sino también al hongo en suelo infestado y la VO a ciertas concentraciones. Su uso se postula como una práctica complementaria dentro del manejo integrado de la VO en Andalucía, en olivares y viveros que usen agua infestada por el patógeno y en aquellos en los que el hongo ya esté establecido en el suelo. Los fabricantes de formulados deberían considerar el desarrollo de productos conteniendo peróxido de hidrógeno para aplicar al agua. | The infestation of irrigation waters by Verticillium dahliae poses a risk for the health of susceptible crops in Andalusia. Spread of conidia and sclerotia of the pathogen via irrigation water has contributed to enlarge the extension and epidemic development of the Verticillium wilt of olive (VWO) throughout this region. The application of chemical disinfectants into the irrigation water has proved to be useful suppressing infestations by V. dahliae conidia. To ascertain the effect against sclerotia -more persistent structures of the fungus- is required before recommending this practice as an exclusion measure within the integrated management of the VWO. Furthermore, the fate of this treated water would be the rhizosphere, so this measure could contribute to eradicate the fungus in the soil and/or reduce the disease in infested olive orchards. The first goal of the present thesis was to evaluate the in vitro efficacy of chemical disinfestation in preventing and eradicating water infestations by V. dahliae sclerotia. Three products differing in composition (OX-VIRIN®, OX-AGUA AL25®, and Deccoklor®) were tested according to the concentration, V. dahliae isolate and time of action. The effect of disinfectants OX-VIRIN® (OV) and OXAGUA AL25® (OA), both including hydrogen peroxide in their formulation, varied with the concentration and time. Suppressive efficacy ranged between 87.8- 100% for the three highest concentrations of OV (3.2-51.2 mL L-1) and 99.6-100% for the two highest of OA (0.4175 y 1.2525 mL L-1) at 5-30 days after the treatment of infested water. These OV concentrations showed higher preventive efficacy than OA concentrations against infestations carried out 30 days after the chemical treatment of the water (97-100% vs. 68,9-100%). The chlorinated product Deccoklor® was ineffective. The potential efficacy of OV and OA in reducing the fungus in the soil and the VO in young olive plants was evaluated in several experiments conducted under growth chamber conditions. The soil-applied disinfectant treatments were also assessed for phytotoxicity on olive plants. Susceptible olive cultivars were grown in V. dahliae-infested soil and subjected to different disinfectant treatments with OV- or OA-treated water. The lowest concentrations recommended for disinfesting V. dahliae-containing water according to results from the previous objective were used (3.2 mL L−1 or 0.4175 mL L−1, respectively). The weekly and monthly treatments with OV and the biweekly treatment with OA decreased solidly the total inoculum density in the soil up to 21.3-29.6% and sclerotia density up to 65.6-91.2%, depending on the treatment. These same disinfectant treatments reduced the disease by 0-40.2% and 3-61.4%, depending on the parameter evaluated, on Picual and Arbequina cultivar, respectively. The tested treatments did not negatively affect the plant growth and phytotoxicity was not observed on any cultivar. Irrigation systems of Andalusian olive orchards allow for the treatment of ponded irrigation water, but also within the distribution network by means of metering pumps. The third part of the thesis addressed the efficacy of injecting disinfectants in the irrigation system in reducing the incorporation and accumulation of V. dahliae in the soil according to the product concentration (OV and OA; 3.2-51.2 mL L-1 and 1.25-11.27 mL L-1, respectively), the type of propagule infesting the water (conidia or sclerotia), and the environmental conditions (spring or fall). The injection of OV and OA prevented or reduced above 95% the accumulation of conidia and sclerotia in both seasons, depending on the concentration applied. The disease was not observed, and the infection prevented or markedly reduced in olive plants raised in soil irrigated with infested and treated water. The last objective of the thesis was to assess the efficacy of injecting the disinfectants within the irrigation system for reducing the V. dahliae inoculum density in soil and the VWO in a long-term experiment conducted under natural environmental conditions. The assessment was carried out combining the Picual cultivar, a highly virulent defoliating pathotype of V. dahliae, and different application strategies with OV (3.2 mL L-1)- and OA (3.76 mL L-1)-treated water for two periods comprising from late winter to late summer. Disinfestation reduced the total inoculum density in soil (by 51.2%, on average) and the disease and infection incidence (by 20.0 and 18.4%, respectively, on average). OA applied twice a month in alternate weeks was the strategy that stood out among the rest by reducing the total inoculum and sclerotia density in soil by 75 and 85.4%, respectively, and symptomatology and infection extent by 53 and 70.8%, respectively, with respect to control. Soil disinfestation, especially following the mentioned OA-strategy, promoted a significantly greater tree recovery from the disease and relieved the reduction in tree growth and production that occurred in infested soils. The disinfectants tested in this work not only reduce water infestations by sclerotia, but also the fungus in soil and the VWO when applied at certain concentrations. Their use could be conceived as a complementary practice within the integrated management of the disease in Andalusian orchards or nurseries using V. dahliae-containing water and in those in which the pathogen is already established in the soil. The development of water disinfectants incorporating hydrogen peroxide in their formulation should be encouraged by manufacturers.

La Verticilosis del olivo (VO) causada por el hongo de suelo y colonizador vascular Verticillium dahliae Kleb., es la enfermedad más grave de este cultivo desde las perspectivas fitopatológica y económica. En el contexto actual de una creciente superficie de olivar en regadío unido al conocimiento de que el riego afecta a la VO y a la posible presencia de V. dahliae en el agua de riego en Andalucía, no solo es importante saber qué estrategia de riego (con agua no infestada) puede contribuir a paliar la VO sino también conocer el estado fitosanitario respecto a V. dahliae del agua de riego para desinfestarla en el caso de estar contaminada. Separar los efectos del agua sobre el desarrollo de la VO de los efectos del aporte reiterado de inóculo a través del agua de riego ayudaría a comprender mejor porqué el riego influye en la VO y a poder integrar ambas medidas de manejo cuando las circunstancias lo requieran. El primer objetivo de este trabajo consistió en evaluar el efecto del riego sobre V. dahliae en el suelo y sobre la VO, ya que para un manejo integrado eficaz de la VO es importante establecer si los tratamientos de riego (usando agua libre de V. dahliae) que minimizan la enfermedad, también reducen el inóculo más y menos persistente del patógeno en el suelo. Para ello, se dispuso un ensayo con la combinación susceptible cultivar de olivo Picual-aislado defoliante (altamente virulento) de V. dahliae bajo condiciones de ambiente natural, donde los plantones crecieron en macetas de grandes dimensiones y se regaron para dos rangos de contenidos de agua en el suelo (RCA; alto y bajo) a tres frecuencias de riego superficial por goteo. En el suelo infestado e independientemente de la temperatura y del RCA, los eventos diarios de riego condujeron a mayores reducciones en la incidencia (39.2%) e índice de intensidad de la enfermedad (43.9%) en los plantones que otras frecuencias de riego, así como de micropropágulos (MpD), o propágulos del hongo menos persistentes (88.0%) en el suelo. A su vez, el RCA alto ocasionó menores niveles de esclerocios o estructuras más persistentes (70.8-84.9%) en el suelo pero un mayor porcentaje de plantones infectados (18.0%) que el RCA bajo, con independencia de la frecuencia de riego. El riego diario a RCA bajo mitigó el desarrollo de la VO y redujo la incidencia de infección, manteniendo el suelo a los niveles más bajos de MpD y resultando en la menor cantidad de esclerocios en el suelo tras dos años y medio. Bajo las condiciones anteriormente descritas (los mismos tratamientos de riego), el siguiente objetivo fue comparar las respuestas morfológicas y fisiológicas en plantones de olivo crecidos en suelo infestado y no infestado por V. dahliae sometidos a tratamientos de riego por goteo que causan reacciones diferenciales a la VO, y determinar cuáles de estas respuestas ayudan a explicar los efectos del riego sobre la enfermedad. De manera general, las respuestas comparadas fueron afectadas por el RCA, la frecuencia de riego y V. dahliae como factores simples. El hongo redujo los parámetros morfológicos y fisiológicos. El riego a RCA alto resultó en una relación de peso seco raíz/planta completa más baja que el RCA bajo, lo que pudo favorecer las infecciones radiculares y la colonización vascular a RCA alto. Además, el riego diario pudo prevenir el incremento en síntomas característico de otras frecuencias de riego por ocasionar los mayores incrementos de crecimiento en longitud y biomasa de la parte aérea del plantón junto con los valores más altos de potencial hídrico, mejorados por una reducción menor de la conductancia estomática. El último objetivo consistió en evaluar la eficacia de la desinfestación química del agua para reducir las conidias de V. dahliae. Tres desinfestantes se testaron por su eficacia frente a infestaciones por conidias previas (eficacia supresiva) y subsiguientes (eficacia preventiva) al tratamiento químico en función de la concentración del desinfestante y la virulencia diferencial de los aislados de V. dahliae sobre olivo. Las concentraciones recomendadas para OX-VIRIN® y OXAGUA AL 25®, basados principalmente en agentes oxidantes y no oxidantes, respectivamente, mostraron mayor eficacia supresiva y preventiva que las recomendadas para el producto a base de hipoclorito de sodio. Los ensayos de simulación de la desinfestación del agua embalsada infestada con conidias realizados en ambiente natural en primavera, demostraron que OX-VIRIN® aplicado cada 28 días al agua a una concentración recomendada por el fabricante fue 100% eficaz después de 56 días. En el contexto actual del olivar en regadío, los resultados obtenidos suponen un avance significativo con relación al manejo del riego para el control integrado de la VO. Se ha demostrado que determinadas estrategias de riego reducen el desarrollo de VO, la infección de los plantones, los propágulos menos persistentes de V. dahliae en el suelo y a medio plazo también los esclerocios; las mismas estrategias de riego en presencia del hongo en el suelo son las que disminuyen menos el uso eficiente del agua y el potencial hídrico entre otros. Existen desinfestantes que aplicados directamente al agua reducen considerablemente a V. dahliae pudiendo disminuir el incremento del hongo en el suelo. | Verticillium wilt of olive (VWO), caused by the vascular-colonizing, soilborne fungus Verticillium dahliae Kleb., is the most serious disease affecting this crop, in terms of the potential phytopathological and economic consequences. The current context of an ever-expanding area dedicated to irrigated olive groves, together with the knowledge that irrigation affects VWO and the possible presence of V. dahliae in irrigation water in Andalusia, makes it important to not only determine which irrigation strategy (with non-infested water) may help mitigate VWO, but also to know the phytosanitary status of irrigation water in terms of V. dahliae infestation, so that it can be disinfected if it is contaminated. Separating the effects of water on the development of VWO from the effects of repeated inoculum supply through irrigation water would help to better understand why irrigation has an effect on VWO, and thus to be able to integrate both management measures when circumstances require it. The first objective of this study was to evaluate the effect of irrigation on V. dahliae in soil and on VWO since, to ensure efficient integrated management of VWO, it is important to establish whether irrigation treatments (with V. dahliaefree water) that mitigate the disease, also reduce the levels of more and less persistent propagules of the pathogen in the soil. To that end, a trial was carried out with the Picual olive cultivar and a highly virulent V. dahliae defoliating isolate. The susceptible combination was placed under natural environmental conditions, where plants were grown in large pots and were irrigated to two ranges of soil water content (RWC; high and low) at three surface drip-irrigation frequencies. In the infested soil, regardless of temperature and RWC, daily irrigation events led to greater reductions in disease incidence (39.2%) and disease intensity index (43.9%) than in plants under other irrigation frequencies, as well as to greater reductions in micropropagules (MpD), or less persistent fungus propagules, in the soil (88.0%). On the other hand, high RWC caused lower levels of sclerotia, or more persistent structures, in the soil (70.8-84.9%), but a higher percentage of infected plants (18.0%) than low RWC, regardless of the frequency of irrigation. Daily irrigation to low RWC helped halt the development of VWO and reduced the incidence of infection, keeping the soil at the lowest levels of MpD and resulting in the least amount of sclerotia in the soil after two and a half years. Under the conditions described above (the same irrigation treatments), the next objective was to compare the morphological and physiological responses in olive plants grown on V. dahliae-infested and non-infested soil, subjected to drip irrigation treatments that cause differential reactions in terms of VWO. The aim was to determine which of these responses help explain the effects of irrigation on the disease. In general, the comparative responses were affected by RWC, irrigation frequency and V. dahliae, as simple factors. The fungus showed reduced morphological and physiological parameters. High RWC irrigation resulted in a lower root weight ratio than with low RWC, meaning that high RWC could favour root infections and vascular colonization. In addition, daily irrigation could prevent the increase in symptoms characteristic of other irrigation frequencies, as a result of the greater growth increases in length and biomass of the aerial part of the plants associated with this irrigation frequency, together with highest water potential values, improved by lower stomatal conductance reduction. The last objective was to evaluate the efficacy of chemical water disinfestation in reducing V. dahliae conidia. Three disinfestants were tested for their efficacy against previous (suppressive efficacy) and subsequent (preventive efficacy) conidia infestations, as a function of the concentration of the disinfestant and the differential virulence of V. dahliae isolates to olive trees. The recommended concentrations for OX-VIRIN® and OX-AGUA AL 25®, which are based primarily on oxidizing and non-oxidizing agents, respectively, showed greater suppressive and preventive efficacy than those recommended for the product based on sodium hypochlorite. Simulated disinfestation assays of stored and conidia-infested water performed under natural environmental conditions in spring demonstrated that OX-VIRIN® applied every 28 days to water at a concentration recommended by the manufacturer was 100% effective after 56 days. In the current context of expanding irrigated olive groves, the results obtained represent a significant advance in relation to irrigation management for the integrated control of VWO. It has been demonstrated that certain irrigation strategies reduce the development of VWO, the infection of the plants, the amount of less persistent propagules of V. dahliae in the soil and, in the medium term, also the sclerotia. In the presence of the fungus in the soil, those same irrigation strategies are the ones that least diminish the efficient water use and the water potential, among others. Disinfestants have also been identified which, when directly applied to the irrigation water, result in considerable reductions in V. dahliae and can help limit the increase of the fungus in the soil.