The role of secreting the factor of polymerization of ActA actin | Роль секреции фактора полимеризации актина ActA для внутриклеточной инфекции Listeria monocytogenes

Английский. The ActA protein is an important virulence factor of the gram-positive pathogenic bacterium Listeria monocytogenes. ActA localization on the bacterial surface polymerizes host actin and provides supply of the L. Monocytogenes with a moving force for intracellular transport and cell-to-cell spreading. ActA is attached to the bacterial surface via the C-terminal membrane anchor. The culture supernatant of in vitro grown L. Monocytogenes contains soluble unattached ActA. The goal of this work was to establish the mechanisms of ActA releasing and possible role of released ActA in L. Monocytogenes intracellular infection. The obtained results demonstrated that ActA releasing was due to specific hydrolysis of the transmembrane anchor. The site of the proteolysis as determined with MALDI-TOF-mass-spectrometry was between His582 and Thr583. His582Pro substitution prevented ActA releasing. The virulence associated metallopro-tease Mpl was not responsible for this specific cleavage that suggested participation of another still unidentified protease. The mutant bacteria unable to release ActA were defected in HeLa cell invasion while they were as affective as the wild type bacteria in the intracellular proliferation and cell-to-cell spreading. The obtained results suggested that ActA releasing might be important for cell invasion but was not required for intra- and inter-cellular transport.

Русский. Бактериальный белок (ББ) ActA является основным фактором патогенности Listeria monocytogenes, вызывающей генерализованную форму листериоза у людей и животных. Перемещение L. monocytogenes внутри цитоплазмы инфицированных клеток и из клетки в клетку связано с активной полимеризацией эукариотического белка актина (АК) ББ ActA, находящимся на бактериальной поверхности и связанным с бактериальной мембраной через карбоксильный трансмембранный домен - "мембранный якорь" (МЯ). Однако при культивировании L. monocytogenes in vitro (среда BHIC-Brain Heart Infusion, усиленная добавлением 0,2%-ного активированного угля) ActA был обнаружен в избыточном количестве не только на поверхности клеток, но и в культуральной жидкости. Изучение механизмов освобождения ActA и роль свободного ActA во внутриклеточной вирулентности показало, что оно происходит в результате протеолитического расщепления МЯ и его освобождение необходимо для эффективной инвазии листерий в эпителиальные клетки. С помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии установлено, что свободный ActA теряет 28 аминокислот карбоксильного конца, формирующих трансмембранную a-спираль, и расщепление ББ происходит между His582 (гистидин) и Thr583 аминокислотой. Замена гистидина в положении 582 на пролин (His582Pro) ингибировала освобождение ActA с бактериальной поверхности. В результате анализа генома L. monocytogenes EGDe выявлено 10 белков, заякоренных на поверхности листерии с помощью МЯ. Один из них, связанный с вирулентностью - белок SvpA был обнаружен на поверхности L. monocytogenes и в культуральной жидкости. Металлопротеаза Mpl, также связанная с вирулентностью и отвечающая за pH-зависимый гидролиз ActA, не участвовала в расщеплении МЯ. Делается вывод, что свободный ActA не участвует в меж- и внутриклеточном перемещении L. monocytogenes, но его присутствие необходимо для эффективной инвазии листерий в эпителиальные клетки. Механизм протеолиза МЯ фактора полимеризации АК ActA, в результате которого мембраносвязанный белок ActA переходит в свободную форму отличается от известного ранее механизма pH-зависимого протеолиза ActA, осуществляемого металлопротеазой Mpl