Ausarbeitung, Validierung und Anwendung einer Methode zur simultanen Bestimmung von Monomethylquecksilber und anorganischem Quecksilber in Fischgewebe und Fischembryonen | Elaboration, Validation and Application of a Method for the simultaneous Determination of Monomethylmercury and Inorganic Mercury in Fish-Tissue and Fish-Embryos

Mercury and its compounds are widely distributed in the biosphere. The dominant mechanism for the current global mercury cycle is atmospheric transport of gaseous (elemental) mercury of natural and anthropogenic origin and its rapid exchange between the atmosphere and the mixed layer of the world oceans. Today, even remote areas give evidence of mercury pollution originating from anthropogenic sources. The major (chemical) forms of mercury occurring in marine waters are elemental mercury (Hg0), inorganic mercury (Hg2+) and organic mercury species, particularly monomethylmercury (CH3Hg+). Monomethylmercury is a bioaccumulative environmental toxicant and its toxic effects have been associated with human death and several ailments that include cardiovascular diseases, anemia, kidney and liver damage, developmental abnormalities, neurobehavioral disorders, autoimmune diseases and cancers in experimental animals. Monomethylmercury plays an important role in environmental pollution, as it can be both anthropogenically introduced, and naturally formed via so-called bio-methylation processes. Methylation of mercury is a key process in the bio-geochemical mercury cycle. It is necessary to speciate and hence distinguishes between inorganic mercury and methylmercury, because the latter is more toxic and more efficiently retained by marine organisms than the first. Speciation also enables a better understanding of the biochemical cycling of mercury in the marine environment. The aim of this study was the development of an inexpensive analytical tool appropriate for future studies of the accumulation of mercury species and their possible impact on marine biota, primarily fish and zooplankton. For this purpose, a sensitive and reliable method for the simultaneous speciation analysis of monomethylmercury and inorganic mercury has been elaborated. Furthermore, it was tested if this elaborated method is suitable for simultaneous determination of monomethylmercury and anorganic mercury in different tissues of pelagic and benthic fish species as well as in pelagic fish eggs. A hyphenated instrumental technique, consisting of purge-and-trap injection-gas chromatography-atomic fluorescence detection after in-situ derivatisation (alkylation) with sodium tetraethylborate was used. The biological material to be analysed was freeze-dried and solubilised with tetramethylammoniumhydroxide (TMAH). A sub-portion of the solution obtained was introduced into an actetate buffer solution (pH 4.75) and the sodiumtetraethylborate reagent was added. The mercury derivatives formed were purged from the reaction mixture with an inert gas (Ar), pre-concentrated (trapped) on a Tenax-TA column, from which they were subsequently thermally desorbed, transferred to a gas chromatograph and separated on an isothermally heated column packed with 15% OV-3 on ChromosorbW (. The mercury derivatives eluting from the GC were pyrolysed in a heated quartz tube interfacing the outlet of the gas chromatograph with an atomic fluorescence spectrometer (AFS) for Hg0 detection. The minimum detectable determinant concentration and the minimum quantifiable determinant concentration estimated for monomethylmercury was 0.95 and 2.85 × 10-6 g × kg respectively, and for inorganic mercury 1.94 and 5.82 ×10-6 g × kg respectively. For the purpose of estimating trueness as part of method validation certified reference materials NRCC-TORT-2 (lobster hepatopancreas reference material for trace metals), NIST-2976 (Mussel tissue) and BCR 414 (Plankton) were analysed. The results of the validation analyses showed that the analytical variance for both monomethylmercury and inorganic mercury respectively was sufficiently small to permit detection of the heterogeneous distribution of the two mercury species within and between a finite number of individual fish specimens. In addition, recovery experiments using cod liver as test material were carried out. Based on the data obtained bias could not be detected for the analytical method tested (P = 0.95). In addition, monomethylmercury and inorganic mercury contents in 100 samples of pelagic fish eggs and about 60 liver an muscle tissue samples of dab (Limanda limanda) and 16 samples of sprat (Sprattus sprattus) were determined. The results showed that the monomethylmercury and inorganic mercury contents found in liver and muscle tissue of dab were similar to concentrations found in earlier studies using other techniques. Furthermore, the methylmercury and inorganic mercury contents found in the dab and sprat samples were comparable to those found in other marine and limnic fish species. Moreover, the method was sufficiently sensitive to determine simultaneously monomethylmercury and inorganic mercury contents in pelagic fish eggs. Therefore, the method elaborated in this study is suitable for routine monomethylmercury and inorganic mercury speciation analysis in zooplankton and fish and therefore the tool of choice to study the accumulation of mercury species and their possible impact on marine organisms.

Quecksilberverbindungen sind ubiquitär in der Umwelt vorhanden und weltweit verteilt. Quecksilber unterliegt, besonders in der Meeresumwelt, zahlreichen biochemischen, physikalischen und geochemischen Umsetzungen. Der wichtigste dabei ablaufende Prozess ist die Methylierung vom anorganischen zum organischen Quecksilber, vor allem zum Monomethylquecksilber. Monomethylquecksilber wird in der marinen Nahrungskette zunehmend angereichert und führt zu starken Belastungen der Meerestiere mit Methylquecksilber auf hoher trophischer Ebene. Aufgrund der sehr hohen Toxizität von organischen Quecksilberverbindungen ist es nötig, die Routineuntersuchungen von Fischen und anderen Meerestieren zum Gesamtquecksilbergehalt um die sog. Speziationsanalytik zu erweitern. Die Speziationsanalytik lässt die Unterscheidung von anorganischen und organischen Quecksilberverbindungen zu. Ziel dieser Arbeit war die Ausarbeitung, Validierung und praxisbezogene Anwendung einer Methode zur simultanen Bestimmung von Monomethylquecksilber und anorganischem Quecksilber in Fischgewebe und Fischembryonen. Bei der Ausarbeitung und Konzeption des entwickelten Analysesystems wurde Wert darauf gelegt, dass verhältnismäßig einfache herzustellende und preiswerte Bauteile zum Einsatz kamen. Kapitel 8.1 beinhaltet eine SOP und eine genaue Beschreibung, welche Komponenten für die beschriebene Methode verwendet wurden, wie diese hergestellt werden können und wie der Zusammenbau zu erfolgen hat. So sollte es für viele Labore leicht möglich sein, den apparativen Aufbau nachzuvollziehen und ihn preiswert nachbauen zu können. Wegen der hohen Leistungsfähigkeit wurde eine gaschromatographische Trennung mit einer selbstgepackten Säule von 75 cm Länge und 4 mm ID, gefüllt mit dem Säulenmaterial 15% OV3 on DMCS WAW, eingesetzt. Als Trägergas wird Helium 5.0 mit einer Flussgeschwindigkeit von 40 ml/min verwendet. Als Detektor kommt ein Kaltdampf-Atomfluoreszenzdetektor (CV-AFS) zum Einsatz, der sich durch hohe Spezifität und durch sehr niedrige Nachweisgrenzen für Quecksilber auszeichnet. Die Extraktion der Quecksilberverbindungen aus der Probenmatrix erfolgt durch Gefriertrocknung, Mikrohomogenisation, Behandlung mit Tetramethylammoniumhydroxidlösung und anschließender Derivatisierung mit Natriumtetraethylborat bei einem pH-Wert von 4,75 (Natriumacetat/Essigsäurepuffer)Besonders fettreiche Proben (>10% Fett) können vor der Extraktion entfettet werden. Die ethylierten Quecksilberspezies lassen sich mit Hilfe eines Argon 5.0-Gasstromes aus der Probenaufschlusslösung austreiben und auf dem Adsorbens Tenax-TA anreichern. Durch Aufheizen des Tenax-TAâ erfolgt die Probenaufgabe in den isothermisch arbeitenden Gaschromatographen. Nach der Trennung der derivatisierten Quecksilberspezies erfolgt dann eine Pyrolyse in einem elektrisch beheizten Quarzrohr mit eingesetztem Platinnetz. Durch die Pyrolyse werden die Quecksilberderivate zu Hg0 reduziert und mit Hilfe des AFS-Detektors detektiert. Die Validierung der Methode in Anlehnung an die EURACHEM-Richtlinien(EURACHEM 1998, QUAM 2000) macht deutlich, dass die entwickelte Methode für den beabsichtigten Zweck geeignet ist und die erforderlichen Qualitätskriterien erfüllt. Durch die entwickelte Messanordnung wurden Nachweisgrenzen von 0,95 und 2,85 × 10-6 g × kg für Methylquecksilber, 1,94 und 5,82 × 10-6 g × kg für anorganisches Quecksilber bei der Untersuchung von Kabeljauleber erreicht. Die Untersuchung der zertifizierten Referenzmaterialien CRM TORT-2 (Hummer Hepatopankreas), NIST-2976 (Muschelfleisch) und BCR CRM 414 (Plankton) zeigt eine gute Übereinstimmung der Messergebnisse mit den zertifizierten Werten. Bei der Untersuchung von ca. 100 Proben pelagischer Fischembryonen, etwa 60 Klieschenfilet- und 60 Klieschenleberproben und 16 Sprottenproben wurden ebenfalls Ergebnisse ermittelt, die sich gut mit Ergebnissen aus anderen Studien decken bzw. im Falle der Fischembryonen sehr plausibel erscheinen. Die Ergebnisse zeigen, dass die entwickelte Methode geeignet ist, die Routineanalytik des Gesamtquecksilbergehaltes der Bundesforschungsanstalt für Fischerei um den Parameter MeHg zu erweitern.