Vitelogénesis de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus (von Martens, 1868; Decapoda: Parastacidae). Caracterización de las moléculas vitelinas y determinación del lugar de síntesis de la Vitelogenina

La vitelogenina (Vg) de la hemolinfa y las vitelinas (Vts) del ovario y de diferentes estadios de desarrollo en huevos de la langosta de agua dulce Cherax quadricarinatus fueron analizados mediante diversas técnicas de electroforesis PAGE, SDS-PAGE y cromatografía. Con estos métodos, en la hemolinfa de hembras en estado de vitelogénesis secundaria, una posible Vg fue encontrada con una masa molecular nativa de 500 kDa. En ovarios y en huevos en estadios I y V, dos formas de Vts (Vt1 y Vt2) fueron observados. En ovarios en vitelogénesis secundaria, la masa molecular nativa fue de 470 kDa (Vt1) y 440 kDa (Vt2). Los huevos en diversos estadios de desarrollo, mostraron un patrón electroforético más complejo, consistente en proteínas con diferentes masas moleculares; en huevos en estadio I, la masa molecular nativa fue de 650 kDa (Vt1) y 440 kDa (Vt2) y huevos en estadio V, la masa molecular nativa fue de 390 kDa (Vt1) y 340 kDa (Vt2). La composición bioquímica de las Vts mostró que se tratan de lipo-glico-proteínas. En el análisis SDS-PAGE una similar composición polipeptídica fue observada en las dos formas de Vts en el ovario y en los huevos en estadio V. En los ovarios, el análisis mostró 4 subunidades con masas moleculares alrededor de 180, 120, 95, y 80 kDa (Vt1 y Vt2) y en huevos en estadio V, masas moleculares de 110, 95, 87, y 75 kDa (Vt1 y Vt2). La composición polipeptídica en las dos Vts en huevos en estadio I y en estadio III fue diferente: 195, 190, 130, y 110 kDa (Vt1) y 116 y 107 kDa (Vt2). En huevos en estadio V fueron también identificadas dos formas de Vts mediante cromatografía en columnas de Sepharose CL-2B y de hidroxilapatita. Dos anticuerpos antivitelina (Ac1 y Ac2) fueron preparados a partir de electroforesis preparativas de extracto de huevos en estadio V y su especificidad fue demostrada por el análisis ELISA, doble inmunodifusión radial y Western blot. Un producto de PCR de 1.1 Kb fue obtenido utilizando ADN genómico de C. quadricarinatus como molde. Se diseñaron oligonucleótidos cebadores a partir del ADNc de la Vg del hepatopáncreas de la misma especie [...]

Vitellogenin (Vg) from hemolymph and vitellins (Vts) from ovaries and eggs with different stage in development of the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus were examined by chromatography, PAGE and SDS-PAGE. With these methods, one possible vitelogenin (Vg) was found in the in secondary vitellogenesis female hemolymph. Native molecular mass was 500 kDa. Two forms of vitellin (Vt1 and Vt2) were observed in ovaries and eggs (stages I and V). In ovaries in secondary vitellogenesis, native molecular mass were 470 kDa (Vt1) and 440 kDa (Vt2); eggs in progressively more advanced development showed a more complex electrophoretic pattern, consisting of proteins with different molecular mass; stage I, 650 kDa (Vt1) and 440 kDa (Vt2); stage V, 390 kDa (Vt1) and 340 kDa (Vt2). The identified vitellins appear to be lipo-glyco-protein. A similar vitellin polypeptide composition was observed in the two forms of vitellin from ovaries and eggs in stage V. In ovaries the SDS-PAGE analysis showed 4 subunits with molecular mass around 180, 120, 95, and 80 kDa (Vt1 and Vt2). The polypeptide composition in the two forms of vitellins in stage I and stage III eggs were different at 195, 190, 130, and 110 kDa (Vt1) and 116 and 107 kDa (Vt2). On the other hand, in stage V eggs, 110, 95, 87, and 75 kDa (Vt1 and Vt2) were identified. Two forms of vitellins were also found in stage V eggs after chromatography on Sepharose CL-2B, hidroxylapatite column, and polyacrylamide gel electrophoresis. Two antibodies (Ab1 and Ab2) were prepared against the purified proteins of stage V eggs and their specificity was demonstrated by ELISA assay, radial immunoprecipitation, and Western blotting analysis. A 1.1 Kb PCR product was obtained using genomic DNA of Cherax quadricarinatus as a template. The PCR product was cloned and sequenced. Total RNA isolated from the hepatopancreas and ovary from spawned for the first time secondary-vitellogenic female was used as a reverse transcription (RT) template to synthesize first strand cDNA [...]