Association analyses to genetically study reproduction and seed quality features of faba bean (Vicia faba L.)

Kacang faba (Vicia faba L.) merupakan tanaman alogami yang dapat melakukan pembuahan sendiri maupun pembuahan silang. Pembuahan sendiri terjadi tanpa adanya bantuan polinator maupun rangsangan mekanik eksternal, yang pada kacang faba dikenal dengan istilah autofertilitas. Level autofertilitas bervariasi di antara genotipe. Ketika pembuahan terjadi, baik pembuahan sendiri maupun silang, jumlah dan kualitas biji sangat menentukan. Biji kacang faba kaya akan protein dan mengandung komposisi nutrisi lain yang bernilai tinggi. Namun demikian, kacang faba mengandung senyawa anti nutrisi, seperti vicin dan convicin, yang membatasi pemanfaatannya sebagai pangan dan pakan serta memiliki dampak kesehatan bagi manusia. Tujuan dari penelitian ini pada bab pertama adalah untuk mempelajari secara genetik dan mengukur level dan variasi autofertilitas pada kacang faba winter yang spesifik dan untuk mengidentifikasi QTL untuk autofertilitas dan karakter terkait. Jadi fokus bab pertama adalah pada pembuahan dan asal biji. Fokus bab kedua adalah pada kualitas biji yang dihasilkan. Penelitian bab kedua bertujuan untuk mengembangkan kalibrasi berbasis NIRS untuk kandungan vicin-convicin pada biji kacang faba, mempelajari heritabilitas dan variasi genetik kandungan vicin-convicin, mengidentifikasi QTL yang berperan untuk variasi genotipe kacang faba yang mengandung vicin-convicin (tipe liar) dan memverifikasi apakah alel mutan yang terdapat pada vicin-convicin alelik dengan QTL pada material yang mengadung vicin-convicin. Sejumlah eksperimen dilakukan di lapang dan laboratorium untuk mempelajari secara genetik karakter reproduksi dan kualitas biji kacang faba. Materi genetik utama yang digunakan pada penelitian ini melibatkan 200 galur murni, bernama set-Q, yang terdiri dari 189 galur set-A (galur murni untuk studi asosiasi), tujuh galur kacang faba winter dan empat galur kacang faba spring. Set-A berasal dari Göttingen Winter Bean Population (GWBP). Studi fitur reproduksi dilakukan pada rumah isolasi bebas lebah pada 2013, 2014 dan 2015. Perlakuan “tripped” dan “un-tripped” diterapkan pada bunga faba selama musim berbunga. Studi kualitas biji (kandungan vicin-convicin) dilakukan dengan menggunakan analisa HPLC dan spektrofotometri NIR pada biji yang dihasilkan pada penelitian sebelumnya. Kami mengembangkan kalibarsi NIRS untuk memprediksi kandungan vicin-convicin berbasis NIRS. Analisis asosiasi seluruh genom (GWAS) antara penanda DNA dengan karakter fenotipik dilakukan dengan menggunakan TASSEL version 3.0. Sebanyak 2018 penanda polimorfik digunakan yang terdiri dari 189 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) dan 1829 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Untuk menentukan autofertilitas, penelitian difokuskan pada karakter prosentase pembuahan, potensi pengisian polong dan pengisian polong sebenarnya, terutama pada perlakuan ‘un-tripped’. Prosentase pembuahan pada perlakuan ‘un-tripped’ rendah, dengan nilai maksimum 37,14% dan heritabiltasnya tinggi. Tripping secara nyata meningkatkan nilai rata-rata ketiga aspek autofertilitas tersebut. Heritabilitas prosentase pembuahan pada perlakuan ‘tripped’ lebih tinggi daripada ‘un-tripped’ yang mengindikasikan perbedaan reaksi tripping merupakan faktor genetik. Tripping yang intens juga mengkonfirmasi hasil tersebut dan menunjukkan bahwa tidak satupun genotype menghasilkan prosentase pembuahan 100%. Hasil penting dari penelitian ini adalah kacang faba winter memiliki level autofertilitas yang berbeda dan lebih rendah dibandingkan dengan kacang faba spring. Teknologi NIRS dapat diterapkan untuk memprediksi kandungan vicin-convicin pada kacang faba. Diperoleh persamaan kalibrasi yang baik dan dapat diterapkan untuk menganalisa contoh biji kacang faba yang dihasilkan pada pengulangan, perlakuan dan tahun yang berbeda. Diperoleh variasi kandungan vicin-convicin yang lebar dan signifikan dengan nilai heritabilitas yang cukup tinggi. Penelitian ini juga menghasilkan beberapa penanda DNA putatif yang secara signifikan terasosiasi dengan beberapa karakter agronomi dan juga kandungan vicin-convicin. Satu penanda AFLP berasosiasi signifikan terhadap variasi vicin-convicin pada genotype, dan dengan menganalisa lebih jauh tiga peta keterpautan yang berbeda dan hubungan sinteni dengan Medicago truncatula, posisi QTL tersebut sangat mungkin berada pada kromosom 5 Vicia faba. Penemuan ini merupakan langkah awal untuk penelitian dan pemuliaan kacang faba winter Eropa yang tinggi fertilitas dengan kualitas biji yang baik.

Die Ackerbohne (Viciafaba) ist eine partiell allogame Pflanze, die zugleich Selbst- als auch Fremdbefruchtung erlaubt. Selbstbefruchtung, welche ohne Bestäuber oder ohne andere externe mechanische Stimuli geschieht, ist die sogenannte Autofertilität. Der Grad dieser Autofertilität variiert zwischen Genotypen. Sobald Samen angesetzt sind, ausSelbstung oder aus Kreuzung, sind die Menge und die Qualität der Samenmasse entscheidend. Ackerbohnen-Samen sind ein proteinreicherRohstoff und bieten eine ernährungsrelevantwertvolle Zusammensetzung. Ackerbohnen enthalten allerdings anti-nutritive Inhaltsstoffe wie Vicin und Convicin, die die Nutzung in Futter oder Nahrungsmitteln begrenzen und für Menschen gesundheitlich bedeutsamsind. Die Ziele des ersten Kapitels dieser Studie sind, das Niveau und die Variation der Au-tofertilität und verwandter Merkmale in einem spezifischen Winterackerbohnen-Genpool züchterisch zu studieren und QTL für Autofertilität und verwandter Merkmale zu identifizieren. Entsprechend fokussiert das erste Kapitel auf die Befruchtung und also auf die Entstehung von Samen. Das zweite Kapitel betrachtet die Qualität von Samen. Es zielt auf die Entwicklung einer NIRS-basierten sogenannten Kalibration für den Vicin und Convicin-Gehalt in Ackerbohnen-Samen, auf die Identifizierung von QTL die für die Variation von Vicin und Convicin in Vicin- und Convicin-enthaltenden Ackerbohnen (Wild-Typ), und auf die Prüfung der Frage, ob das Mutanten-Allel „vc-“ der Ackerbohne kosegregiert mit einem Vicin-Convicin-QTL in Vicin und Convicin-enthaltendem Material. Mehrere Feld- und Laborversuche wurden durchgeführt, um züchterisch Reproduktionsmerkmale und Samenqualität der Ackerbohne zu studieren. Das hauptsächliche genetische Material, welches in der hier vorliegenden Studie benutzt wurde, umfasst 200 Inzuchtlinien, genannt Q-Satz, der aus 189 Linien des A-Satzes besteht (Inzuchtlinien für Assoziationsanalyse), sieben weitere Winterbohnen-Inzuchtlinien und vier Sommerbohnen-Linien. Der A-Satz war aus der sogenannten Göttinger Winterackerbohnen-Population (GWBP) entwickelt worden. Die Versuche zum Studium der Reproduktion wurden in sogenannten bienensicheren Isolierhäusern durchgeführt, in den Sommern 2013, 2014 und 2015. Als Behandlung wurden die Ackerbohnenblüten während der Blütezeit „getrippt“ oder „ungetrippt“ gelassen. Die Versuche zur Analyse der Samenqualität (Vicin- und Convicin-Gehalt) wurden mit HPLC und NIR-spektroskopischer Analyse der Ackerbohnen-Samen durchgeführt; diese waren von den oben genannten Versuchen geerntet worden. Es wurde eine NIRS Kalibration entwickelt, um eine NIRS-basierte Vorhersage des Samen-Vicin- und Convicin-Gehaltes zu erlauben. Genomweite Assoziationsanalysen zwischen DNS-Markern und der phänotypischen Merkmalsausprägung wurden mittels TASSEL (Version 3.0) durchgeführt. Es wurden insgesamt 2018 polymorphe Marker benutzt, die aus 189 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) und aus 1829 AFLP (Amplified Fragment LengthPolymorphism) bestanden. Um die Autofertilität zu bestimmen, konzentrierte sich die Studie auf die Befruchtungsrate, das Hülsenfüllungs-Potential und die realisierte Hülsenfüllung, besonders in der ungetrippten Behandlung. Die Befruchtungsrate in der ungetrippten Behandlung war niedrig, mit einem Maximum von 37,14%, und einer hohen Erblichkeit. Das Trippen erhöhte offensichtlich den Mittelwert der drei Autofertilitäts-Aspekte. Die höhere Erblichkeit der Befruchtungsrate in der getrippten Behandlung, im Vergleich zu ungetrippt, ist ein Indiz für genetische Unterschiede in der Reaktion auf das Trippen. Intensives Trippen, welches durchgeführt wurde, bestätigte die Ergebnisse und zeigte, dass keiner dieser Genotypen eine 100% Befruchtung (Autofertilität) zeigte. Ein wesentliches Ergebnis der vorliegenden Studie war, dass Winterackerbohnen eine andere, niedrigere Autofertilität haben als Sommerackerbohnen. NIRS Technologie kann zur Vorhersage des Vicin- und Convicin-Gehaltes von Ackerbohnen eingesetzt werden. Eine relativ gute Kalibrationsgleichung wurde entwickelt und zur Analyse von Ackerbohnen-Samenproben aus verschiedenen Wiederholungen, Behandlungen und Jahren eingesetzt. Signifikante und große quantitative Unterschiede wurden mit hoher Erblichkeit für Vicin und Convicin-Gehalt gefunden. Diese Studie ergab mehrere mutmaßliche DNS-Marker, die signfikant zu mehreren der agronomischen Merkmale der Ackerbohnen und zum Vicin und Convicin-Gehalt in Beziehung stehen. Ein AFLP-Marker war signifikant mit dem Vicin und Convicin-Gehalt assoziiert; mittels sorgfältiger Durchsicht von drei verschiedenen Kopplungskarten und der syntänischen Beziehung zu Medicagotruncatula wurde die sehr wahrscheinliche Position dieses QTL bestimmt, als auf dem Chromosom 5 von Viciafaba liegend. Die vorgestellten Befunde sind ein weiterer Schritt voran in Forschung und Züchtung von hoch fertilen europärchen Winterackerbohnen mit verbesserter Samenqualität.

Faba bean (Vicia faba L.) is an allogamous plant which allows both self and cross fertilization. Self fertilization which occurs without pollinators or without any other external mechanic stimulus in faba bean is the so-called autofertility. The degree of such autofertility varies among genotypes. Once the seed is set, either by selfing or by crossing, the amount and quality of the seed mass is decisive. Faba bean seeds supply rich-protein content feedstuff and provide a valuable nutrition composition. However, faba bean contains anti-nutritive compounds such as vicine and convicine which limit its use in feed and food systems and have health impact for human. The objectives of the first chapter of the present study are to genetically study and quantify level and variation of autofertility in a specific winter faba bean breeding germplasm and to identify QTL for autofertility and related traits. Hence, the first part’s focus is on fertilization and thus genesis of seed. The second chapter’s focus is on the quality of seed. It aims to develop a NIRS-based so-called calibration for the vicine-convicine content in faba bean seed, to study heritability and genetic variation of vicine-convicine content in faba bean, to identify QTLs that are responsible for vicine-convicine variation in vicine-convicine-containing (wild-type) faba bean genotypes and to verify whether the mutant allele for vicine-convicine in faba bean (“vc-”) is allelic to a QTL for the variation in vicine-convicine-containing materials. A number of field and laboratory experiments were carried out to genetically study features of reproduction and of seed quality of faba bean. The main genetic materials used in this study involved 200 inbred lines, named Q-set, which consisted of 189 lines of A-set (inbred lines for association study), seven further winter bean lines and four further spring bean lines. The A-set was derived from the so-called Göttingen Winter Bean Population (GWBP). The experiments to study features of reproduction were conducted in so-called bee-proof isolation houses in 2013, 2014 and 2015. Treatments of “tripped” and “un-tripped” were applied to the faba bean flowers during flowering time. The experiment to study seed quality (vicine-convicine content) was carried out by HPLC and by NIR-spectrophotometry analysis of the faba bean seeds harvested from the above-mentioned experiments. We developed a NIRS calibration to allow for a NIRS-based prediction of seed vicine-convicine content. Genome-wide association analyses between DNA-markers and phenotypic expression of traits was carried out using TASSEL version 3.0. A total of 2018 polymorphic markers were used consisting of 189 SNP (Single Nucleotide Polymorphism) and 1829 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). To assess autofertility, the study focused on rate of fertilization, potential pod filling and actual pod filling, especially in un-tripped treatment. Rate of fertilization of un-tripped treatment was low, with maximum of 37.14%, and high in heritability. Tripping obviously increased the mean values of the three aspects of autofertility. Higher heritability of rate of fertilization in tripped than in un-tripped treatment indicated genetic differences for the reaction of tripping. Intensive tripping that has been carried out confirmed the result and showed that none of these genotypes showed a 100% result for rate of fertilization. A major result from the present study was that winter faba bean has a different, lower level of autofertility than spring beans. NIRS technology can be applied to predict vicine-convicine content in faba bean. A relatively well-performing calibration equation was produced and applied to analyse samples of faba bean seeds across different replicates, treatments and years. Significant and large quantitative variations were found for vicine-convicine content with relatively high heritability. Our study resulted in several putative DNA-markers which are significantly related to several of the agronomic features in faba bean as well as to vicine-convicine content. One AFLP-marker was significantly associated to the vicine-convicine variation in the genotypes and, by carefully inspecting three different linkage maps and the syntenic relationship to Medicago truncatula, the very probable position of that QTL was determined on chromosome number 5 of Vicia faba. The presented findings are a further step forward in research and breeding of highly fertile European winter faba beans with improved seed quality.