Hydrophobins in wood biology and biotechnology | Hydrophobinen in Holz Biologie und Biotechnologie

Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von Hydrophobinen beim Holzabbau und ihre Fähigkeit, Oberflächen insbesondere Holzoberflächen - zu beschichten, zu untersuchen. Hydrophobine sind kleine amphipatische pilzliche Proteine, die dafür bekannt sind, die Oberflächenspannung von feuchten Oberflächen zu vermindern (Wasser/Luft-Grenzflächen), die Bildung von Lufthyphen durch Beschichtung mit einem hydrophoben Proteinfilm zu erleichtern und das Anhaften von pilzlichen Hyphen an hydrophobes Material zu unterstützen. Das SC3-Hydrophobin von Schizophyllum commune ist bisher das bestuntersuchte Klasse I-Hydrophobin. Ein weiteres Protein, SC15, unterstützt SC3 bei der Bildung von Lufthyphen und ihrer Anheftung an Oberflächen. In Abwesenheit des SC3-Hydrophobins verleiht es Hyphen eine geringe Hydrophobizität. Da von dem Weißfäulepilz S. commune SC3- und SC15-Hydrophobin-Mutanten existieren, wurde diese Art ausgewählt, um die Funktion dieser Proteine bei Holzbesiedelung und -abbau zu untersuchen. Versuche mit Holzblöcken und Sägemehl mit verschiedenen S. commune-Stämmen haben gezeigt, dass sowohl pilzliche Mono- als auch Dikaryen - einschließlich co-isogenen Wildtyp-Stämmen, ΔSc3-Mutanten, ΔSc15-Mutanten und ΔSc3-ΔSc15-Doppelmutanten - auf Buchen-, Birken- und Kiefernholz wachsen konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass weder SC3 noch SC15 notwendig sind, damit S. commune in das Holz eindringen, das Holz abbauen und die Holzfestigkeit beeinflussen kann. Allerdings unterschied sich das Ausmaß der Myzelbildung an der Holzoberfläche in Abhängigkeit vom Vorhandensein von SC3-Hydrophobin. Meistens war der Holzabbau durch die Pilzstämme gering (Laubholz) oder fand nicht statt (Kiefernholz). Bei den Versuchen mit Holzblöcken und Sägemehl betrug der maximale Abbau durch S. commune-Stämme 4-5% (Buche und Birke) bzw. 9-16% (Buche und Kiefer). S. commune-Stämme entfärbten das Kiefernsägemehl, nicht aber das Buchen- und Birkensägemehl. Obwohl die Holzblöcke nur geringfügig oder gar nicht abgebaut wurden, wurde die Holz festigkeit negativ durch die S. commune-Stämme beeinflusst. Der maximale Festigkeitsverlust durch S. commune-Stämme betrug bei Buche, Birke bzw. Kiefer 21, 52 bzw. 35%.S. commune ist ein opportunistischer Krankheitserreger von geschwächten Bäumen. Die Besiedelung eines Juglans ailantifolia-Baumes durch den Pilz wurde während einer Zeitspanne von drei Jahren beobachtet. Der Pilz verursachte während dieser Zeit das Absterben mehrerer Äste. An mindestens einem Ast war S. commune nicht der einzige Pilz. Neben Fruchtkörpern von S. commune wurden solche von Trametes hirsuta gefunden. Beide Pilze wurden von diesem Baum isoliert und ihre Interaktion untersucht.Interaktionsuntersuchungen von S. commune und T. hirsuta resultierten im Deadlock -Phänomen, bei dem sich eine Grenzzone zwischen den Pilzstämmen bildet, in der das Weiterwachstum der Opponenten verhindert wird. Mit fortschreitender Zeit verdrängte T. hirsuta S. commune. Als Stressreaktion während der Konkurrenzsituation war eine blaue Pigmentierung an der pilzlichen Interaktionszone zu beobachten. Alle S. commune-Stämme (monokaryotische und dikaryotische Wildtyp-Stämme und monokaryotische Hydrophobin-Mutanten) außer der dikaryotischen SC3-Hydrophobin-Mutante bildeten die Grenzzone und Pigmentierung in der Interaktionszone aus. Dies deutet darauf hin, dass das SC3-Hydrophobin nicht essentiell an der Stressreaktion von S. commune beteiligt ist.Protein- und Polysaccharid-Produktion eines S. commune-Wildtyp-Stamms und einer co-isogenen Hydrophobin-Mutante in Flüssigkultur wurden verglichen. In Flüssigkultur wurde mittels FTIR-(Fourier-Transform-Infrarot)-Spektroskopie festgestellt, dass sich die Protein- und Polysaccharidgehalte im Myzel des Wildtyps und der Hydrophobin-Mutante signifikant unterscheiden. Der Proteingehalt des Wildtyps war höher als der in der Mutante, während der Polysaccharidgehalt der Mutante mit der Zeit höher war. Myzel von verschiedenen Wildtyp-Stämmen und co-isogenen Mutanten, das auf der Oberfläche von Buchenholz gewachsen war, wurde durch Clusteranalyse von FTIR-Spektren voneinander unterschieden. FTIR-Spektren von Myzel verschiedener Wildtyp-Stämme und co-isogener Mutanten, das im Holz gewachsen war, bildeten einen gemeinsamen Cluster. Die Flächen der Protein- Peaks der untersuchten Stämme unterschieden sich auf der Holzoberfläche nicht signifikant voneinander. Die Flächen der Polysaccharid- Peaks der dikaryotischen SC3-Hydrophobin-Mutante ΔSc3 4-39 x ΔSc3 4-40 waren auf der Holzoberfläche hingegen signifikant höher als die der monokaryotischen Mutanten ΔSc3 4-39 und ΔSc3 4-40.Das SC3-Hydrophobin von S. commune wurde aus dem Pilzmyzel mit einem Ertrag von 0.1 % (w/w, 0.5 mg an SC3-Hydrophobin aus 500 mg Myzel) aufgereinigt und zum Beschichten von hydrophobem und hydrophilem Material verwendet. Hydrophobes Teflon und Formwar-Filme wurden hydrophil und hydrophiles Glas wurde hydrophob nach Beschichtung mit SC3-Hydrophobin. Weiter wurden die amphipatischen Eigenschaften von Proteinfilmen auf Buchenholz getestet. Buchenholz wurde in Abhängigkeit von der verwendeten SC3-Konzentration hydrophil oder hydrophob. Niedrige SC3-Konzentrationen (50, 25, 15 µg/ml) bewirkten Hydrophobie und hohe Konzentrationen (100 bis 400 µg/ml) Hydrophilie bei Buchenholz. Oberflächen-Aktivitäten weiterer Klasse I-Hydrophobine von anderen Pilzarten wurden an Buchenholz untersucht. Circa 0,3 bis 0,1% (w/w) Hydrophobin ließ sich aus Myzel von Coprinopsis cinerea und Pleurotus ostreatus-Kulturen aufreinigen. Die Hydrophobine dieser beiden Pilze wiesen die gleichen Eigenschaften bezüglich der Oberflächenaktivität auf Holz auf wie das SC3-Hydrophobin. ATR-FTIR-(Abgeschwächte Totalreflexions-Fourier Transform Infrarot)-Spektren von mit Hydrophobin behandeltem Holz zeigten eine höhere Peak-Intensität in dem Spektralbereich, der der Amid I-Bande von Proteinen zugeschriebenen wird, als unbehandeltes Holz, was für die Bindung der Hydrophobine an Holzkomponenten spricht.

The main aims of this research were to study the role of hydrophobins in wood decay processes and to test the ability of these proteins to coat surfaces, particularly wood surfaces. Hydrophobins are small amphiphatic fungal proteins that are known to decrease the surface tension of moist surfaces (water/air interfaces), to help in the formation of aerial hyphae by coating them with a protein film and making them hydrophobic and to support attachment of the fungal hyphae to hydrophobic materials. The SC3 hydrophobin from Schizophyllum commune is the best studied hydrophobin until now. Another protein, SC15, is known to act supportive to the SC3 hydrophobin in the formation of aerial hyphae and their attachment to surfaces and, in the absence of the SC3 hydrophobin, it mediates low levels of hyphal hydrophobicity and attachments. Due to the existence of several SC3 hydrophobin and SC15 mutant strains, the white rot fungus S. commune was selected for this study to study the functions of these proteins in wood colonization and decay. Wood block and saw dust tests with various S. commune strains showed that both fungal monokaryons and dikaryons, including co-isogenic wild type strains, ΔSc3 mutants, ΔSc15 mutants and ΔSc3 ΔSc15 double mutants, were able to grow on beech, birch and pine wood. The obtained results indicate that neither the SC3 hydrophobin nor the SC15 protein are principally necessary for S. commune to enter into the wood, to decay the wood or to affect the strength to the wood. However, there were differences in the overall formation of surface mycelium in correlation of the presence of the SC3 hydrophobin. In most instances, the wood decay by the fungal strains were low (deciduous wood) or there was no decay (pine wood). In wood block and saw dust decay tests, the maximum decay caused by S. commune strains was 4-5% (beech and birch), and 9-16% (beech and birch), respectively. S. commune strains decolorized the pine saw dust but not beech or birch saw dust. Although there was only little or no decay in wood blocks, the strength of the wood was negatively affected by S. commune strains. The maximum strength loss caused by S. commune strains in beech, birch and pine wood was 21, 52 and 35 %, respectively.S. commune is an opportunistic pathogen on weakened trees. An infestation of a Juglans ailantifolia tree by the fungus was observed over a period of 3 years. The fungus caused over the time die off of a number of branches. In at least one branch, S. commune was not the only fungus. Next to S. commune fruiting bodies, carpophores of Trametes hirsuta were observed. Both fungi were isolated from the tree and studied in interactions. Furthermore, SC3 hydrophobin mutants and their co-isogenic wild type strains were included in the study.Interaction studies of S. commune strains with T. hirsuta on agar plates resulted in the deadlock phenomenon in which a barrier is formed between the fungal strains hindering the opponents in further growth. Subsequently with time, the deadlock situation changed by the partial replacement of S. commune by T. hirsuta. As a stress reaction during the combat interaction, a blue pigmentation was observed at the fungal interaction zone. All the S. commune strains (monokaryotic and dikaryotic wild type strains and hydrophobin monokaryon mutants) except the SC3 hydrophobin mutant dikaryon showed the barrier formation and the pigmentation in the interaction zone, indicating that in principle the SC3 hydrophobin is not involved in the stress reactions of S. commune.Further, differences between a S. commune wild type strain and a coisogenic hydrophobin mutant were studied in liquid cultures in relation to the produced protein and polysaccharide. In the liquid cultures, as determined by the FTIR (Fourier Transform Infrared) spectroscopy analysis, there were significant differences between the mycelium of the wild type strain and the mycelium of the hydrophobin mutant with respect to protein and polysaccharide contents. The protein content were higher in the wild type strain than in the mutant, whereas the polysaccharide content was higher over the time in the mutant strain. When growing on beech wood, the mycelium of different S. commune wild type strains and the co-isogenic hydrophobin mutants on the surface of the wood were discriminated by FTIR spectra submitted to a cluster analysis. Inside the wood, however, the FTIR spectra of the mycelia of the different S. commune wild type strains and hydrophobin mutants clustered together. There were no significant differences noted amongst the values from protein peak area values calculated from the FTIR spectra in between the tested strains on the surface of beech wood. On the surface of wood, the polysaccharide peak area value of the dikaryotic Sc3 hydrophobin mutant ∆Sc3 4-39 x ∆Sc3 4-40 was significantly higher than that of the monokaryotic mutants ∆Sc3 4-39 and ∆Sc3 4-40.SC3 hydrophobin of S. commune was purified from fungal mycelium with yields of 0.1% (w/w, 0.5 mg of SC3 hydrophobin from 500 mg of mycelium) and used to coat hydrophobic and hydrophilic materials. Hydrophobic Teflon and form-war film turned hydrophilic and hydrophilic glass turned hydrophobic upon coating with SC3 hydrophobin. Further, the amphipathic nature of films of this protein was tested on solid beech wood. Beech wood turned hydrophilic or hydrophobic, depending on the concentration of SC3 hydrophobin applied. Lower concentrations (50, 25, 15 μg/ml) of SC3 resulted in hydrophobic behavior and higher concentrations (100 to 400 μg/ml) in hydrophilic behavior of beech wood. The surface activity of other class I hydrophobins from different fungal species were also tested on the beech wood. About 0.3 and 0.1% (w/w) purified hydrophobins were obtained from the mycelium of Coprinopsis cinerea and Pleurotus ostreatus cultures, respectively. The hydrophobins of both fungi followed the same pattern of surface activity on wood than the Sc3 hydrophobin. Results from ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection - Fourier Transform Infrared) spectra of hydrophobin-treated beech wood showed a higher intensity in the peak associated with amide I band of proteins indicating the binding of hydrophobin protein to the wood components.