Rol del complejo RUNX1-CBF-β/HIPK2/p300/p53 en la evolución leucémica de las neoplasias mieloproliferativas crónicas

Chronic myeloproliferative neoplasms (MPNs) are carcinogenic processes in which there is a clonal expansion of one or more populations of myeloid hematopoietic progenitors. In the initial stages of the disease, they present an adequate cell differentiation, which entails a final decompensation of the different cell types in bone marrow and peripheral blood and the consequent appearance of associated symptoms that can lead to significant cytopenias or vascular complications. Despite MPNs can be kept relatively controlled in their chronic phase through proper treatment, these pathologies have a natural tendency to evolve, after a variable period of time, towards a more aggressive state of the disease and the development of acute leukemia, which is the most critical phase of the MPNs. Therefore, patients prognosis is determined by vascular complications and leukemic transformation. This transformation risk is maximum in chronic myeloid leukemia BCR-ABL positive, but the existence of very effective treatments to eliminate the leukemic clone has allowed modifying the natural history of this disease and substantially improving the prognosis of patients. On the contrary, there are currently no similar treatments that allow modifying the risk of acute transformation of negative BCR-ABL MPNs, in which the treatment is aimed at controlling symptoms and preventing vascular complications. The leukemic phase of NMPs has an unfortunate prognosis, being the most treatment-resistant type of leukemia. The median survival in this phase is about months and only allogeneic transplantation can cure the disease in a small proportion of cases. The molecular and genetic mechanisms involved in the leukemic transformation are not accurately known, therefore their research is relevant in order to understand the molecular associated events and search for new therapeutic targets. RUNX1 (AML1) is a transcription factor with a great importance in hematopoietic development, also closely associated with leukemogenesis, being frequently altered via mutation or translocation in human leukemia, especially those of myeloid lineage. In addition, it is one of the most frequently altered genes in the acute transformation phase of MPNs. RUNX1 does not act alone, but requires the activity of its transcriptional cofactor CBF-β, therefore different alterations of the RUNX1-CBF-β complex have being also found in myeloid neoplasms. Together, both genes control fundamental processes of normal and malignant hematopoietic, such as cell proliferation and differentiation. Another gene highly altered in the transforming phase of MPNs is TP53. It is not surprising this gene has an important role in the leukemic development, since it controls key oncologic pathways such as cellular response to stress, apoptosis and drug resistance. RUNX1 and TP53 alterations are highly frequent in the leukemic transformation phase of the MPNs. Recently, it has been described that both the activity of the RUNX1-CBF-β and that of TP53 are regulated by the interaction with p300 and HIPK2 proteins. In fact, HIPK2 is responsible for phosphorylating RUNX1, p53 and p300, and those phosphorylations are necessary for their functions. On the other hand, p300 regulates HIPK2 activity and stability, and activates the RUNX1-CBF-β and p53 transcriptional machinery, once both (and p300) have been previously activated by HIPK2. Finally, there is also data in the literature concerning the mediating role of CBF-β in the p53 transcriptional pathway. Based on the above-mentioned data, the main aim of this PhD is the study of the interactions between these five genes, as a possible bi-directional transcriptional complex (proliferation-differentiation and apoptosis-pharmacological resistance), in the leukemic evolution phase of the MPNs. In order to fulfill this objective, the molecular, cytogenetic and functional state of these five genes has been analyzed through different molecular techniques in acute MPNs cell lines, obtaining a complete molecular and cytogenetic characterization of the proposed complex in the context of these pathologies. On the other hand, the possible leukemic functions of the latter have been explored by chemical or biological manipulation of the HIPK2 and EP300 regulatory genes in cell lines and cultured patient samples, obtaining significant effects in the leukemic cell lines homeostasis after such manipulation. Finally, the effect of drugs used for the treatment of these hemopathies has been evaluated in both types of samples based on the state of activity of the previously manipulated complex, significantly influencing the way in which the leukemic cells respond to the conventional treatments that are used in the therapeutics of these pathologies.

Las neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMPs) son procesos cancerígenos en los que se produce una expansión clonal de una o varias poblaciones de progenitores hematopoyéticos de estirpe mieloide. En las fases iniciales de la enfermedad, éstos presentan una adecuada diferenciación celular, lo que conlleva una descompensación final de los diferentes tipos celulares en médula ósea y sangre periférica y la consiguiente aparición de una serie de síntomas asociados que pueden llegar a producir importantes citopenias o complicaciones vasculares. A pesar de que las NMPs pueden mantenerse relativamente controladas en su fase crónica mediante un tratamiento adecuado, éstas patologías tienen una tendencia natural a evolucionar, tras un intervalo de tiempo variable, hacia un estado más agresivo de la enfermedad y el desarrollo de leucemia aguda, lo que supone la fase más crítica de las NMPs. Por todo ello, el pronóstico de los pacientes está determinado por las complicaciones vasculares y la transformación leucémica. Éste riesgo de transformación es máximo en la leucemia mieloide crónica BCR-ABL positiva, pero la existencia de tratamientos muy eficaces para eliminar la clona leucémica ha permitido modificar la historia natural de esta enfermedad y mejorar sustancialmente el pronóstico de los pacientes. Por el contrario, no existen por el momento tratamientos similares que permitan modificar el riesgo de transformación aguda de las NMPs BCR-ABL negativas, donde el tratamiento va dirigido a controlar los síntomas y prevenir las complicaciones vasculares. La fase leucémica de las NMPs tiene un pronóstico infausto, siendo el tipo de leucemia más resistente al tratamiento. La mediana de supervivencia en esta fase es de meses y sólo el trasplante alogénico permite curar la enfermedad en una proporción reducida de casos. Los mecanismos moleculares y genéticos implicados en la transformación leucémica no se conocen con precisión, por ello es de relevancia su investigación, con el fin de comprender los eventos moleculares asociados y buscar nuevas dianas terapéuticas. RUNX1 (AML1) es un factor de transcripción con gran importancia en el desarrollo hematopoyético, muy asociado también al desarrollo leucémico, encontrándose frecuentemente alterado, vía mutación o translocación en las leucemias humanas, sobre todo en las de estirpe mieloide. Además, es uno de los genes más frecuentemente alterado en la fase de trasformación aguda de las NMPs. RUNX1 no actúa en solitario, sino que requiere la actividad de su cofactor transcripcional, CBF-β, habiéndose encontrado también diversas alteraciones del complejo RUNX1-CBF-β en las neoplasias mieloides. Ambos genes controlan procesos fundamentales de la hematopoyesis normal y maligna cómo la proliferación y la diferenciación celular. Otro gen altamente alterado en la fase transformante de las NMPs es TP53. No es de extrañar que este gen tenga un papel importante en el desarrollo leucémico, puesto que controla rutas clave de los procesos oncológicos cómo las vías de respuesta al estrés celular, apoptosis y resistencia farmacológica. Las alteraciones en RUNX1 y TP53 son muy frecuentes en la fase de trasformación leucémica de las NMPs. Recientemente se ha descrito que tanto la actividad del dúo RUNX1-CBF-β, como la de TP53, están reguladas por la interacción con las proteínas p300 y HIPK2. De hecho, HIPK2 se encarga de fosforilar a RUNX1, p53 y p300, siendo necesarias dichas fosforilaciones para que se lleven a cabo sus funciones. Por otra parte, p300 se encarga también de regular la actividad y estabilidad de HIPK2, así como de activar la maquinaria transcripcional de RUNX1-CBF-β y de p53, una vez que ambos (y p300) han sido activados por HIPK2. Por último, existen también datos en la literatura acerca del rol mediador de CBF-β en la ruta transcripcional de p53. En base a los datos anteriormente expuestos, esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal el estudio de las interacciones de estos cinco genes, a modo de posible complejo transcripcional bidireccional (proliferación-diferenciación y apoptosis-resistencia farmacológica), en la fase de evolución leucémica de las NMPs. Con el fin de cumplir este objetivo, se ha analizado el estado molecular, citogenético y funcional de los 5 genes mediante diferentes técnicas moleculares en líneas celulares de NMPs agudizadas, obteniéndose una caracterización molecular y citogenética completa del complejo propuesto en el contexto de estas patologías. Por otra parte, se han explorado las posibles funciones leucémicas de éste mediante la manipulación química o biológica de los genes reguladores HIPK2 y EP300 en líneas celulares y muestras de pacientes en cultivo, obteniéndose efectos significativos en la homeóstasis de las células leucémicas tras dicha manipulación. Por último, se ha evaluado en ambos tipos de muestras el efecto de fármacos usados en el tratamiento de estas hemopatías en función del estado de actividad del complejo, previamente manipulado, logrando influir significativamente en la manera en la que las células leucémicas responden a los tratamientos convencionales de estas patologías.