Estabilidad del mRNA de rbcL en el cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii: Papel de la 5' UTR

RESUMEN La longevidad de los transcritos del gen cloroplástico rbcL en Chlamydomonas reinhardtii depende de la presencia de una corta secuencia de 10 nucleótidos localizada en el extremo 5´ del mRNA. Este elemento de secuencia forma parte de una estructura secundaria que, probablemente, también es importante para la estabilidad de los transcritos de rbcL. Utilizando genes quiméricos constituidos por modificaciones de la 5´UTR de rbcL y la secuencia codificante del gen uidA, como gen reportero, e introduciéndolos en el cloroplasto de C. reinhardtii se ha podido determinar los requisitos de secuencia y de conformación esenciales para la estabilidad de estos transcritos. Los cambios realizados afectan a la secuencia del extremo 5´, a su estructura secundaria o a ambos. Cambios de la secuencia de la estructura secundaria localizada en el extremo 5´ (p.e. haciendo mayor o menor el stem o la horquilla) no tienen efecto en la vida media de los transcritos siempre y cuando mantengan la secuencia y la conformación de la base de la misma que afecta al elemento de estabilidad. En cambio, cualquier cambio nucleotídico que altere la conformación del elemento de estabilidad produce la rápida degradación de los transcritos. La conformación del elemento de estabilidad debe de contener los cuatro primeros nucleótidos, desde +38 hasta +41, en doble cadena, formando la base de la primera estructura secundaria. Las posiciones centrales, +42 (C), +43 (C) y +44 (G), deben de quedar en simple cadena mientras que las posiciones 3 del elemento, +45, +46 y +47, quedan en doble cadena, formando parte de la base de la segunda horquilla. Los resultados sugieren que, para que el elemento de estabilidad sea funcional sus 10 nucleótidos deben de quedar plegados en esta conformación. En C. reinhardtii se han descrito interacciones entre elementos cis, localizados en la 5´UTR de mRNA específicos cloroplásticos, y proteínas citosólicas que median de manera específica la estabilidad de estos mensajeros. Los mecanismos moleculares responsables del control de la estabilidad de los mRNAs cloroplásticos, aunque no se conocen en detalle, parecen basarse en estas interacciones. Los requisitos de secuencia y conformación de la 5´UTR de rbcL sugieren que la vida media de estos transcritos depende de la asociación del elemento de estabilidad con elementos trans que protegen el transcrito del ataque de las ribonucleasas y, de este modo, modulan su longevidad. Hasta el momento, no se ha descrito ninguna proteína implicada en el control de la estabilidad de este mensajero. Con objeto de identificar proteínas de unión a esta región se planteó una aproximación bioquímica in vivo de búsqueda global de proteínas de unión a un transcrito quimérico gobernado por la 5´UTR de rbcL. Se irradiaron con luz ultravioleta células vivas de C. reinhardtii, fijando así las interacciones directas entre el RNA y las proteínas que en ese momento del ciclo celular estén unidas al RNA quimérico in vivo. Los aductos RNA-proteínas obtenidos tras la irradiación se observaron como una banda retardada. Las proteínas asociadas se analizaron por espectrometría de MS/MS. De entre las proteínas identificadas en la banda de retardo en gel destacan la proteína disulfuro isomerasa (PDI) y la proteína de unión a RNA (RB38). Se ha corroborado in vitro la unión de éstas a la 5UTR de rbcL. Estos resultados se ven apoyados tanto por la función de estas proteínas como por el hecho de que se han descrito formando parte de un complejo proteico con capacidad de unión a la 5UTR del mRNA de psbA. Estas proteínas resultan prometedoras ya que, a través de ellas, se pueden diseñar nuevas aproximaciones que permitan acotar la búsqueda de las proteínas de unión específicas. __________________________________________________________________________________________________

RNA secondary structures, e.g. stemloops that are often found at the 5 and 3 ends of mRNAs, are in many cases known to be crucial for transcript stability but their role in prolonging the lifetime of transcripts remains elusive. In this study we show for an essential RNA-stabilizing stemloop at the 5 end of rbcL gene transcripts in Chlamydomonas reinhardtii that it neither prevents ribonucleases from binding to the RNA nor impedes their movement along the RNA strand. The stemloop has a formative function in which it mediates folding of a short 10 nucleotides sequence around its base into a specific RNA conformation, consisting of a helical and single stranded region, i.e. the real structure required for longevity of rbcL transcripts in chloroplasts. Disturbing this structure renders transcripts completely unstable, even if the sequence of this element is not altered. The requirement of a specific 5 sequence and structure for RNA longevity suggests an interaction of this element with a trans-acting factor that protects transcripts from rapid degradation in chloroplasts. At the moment, no protein has been described with specific affinity for this region. We have planned a biochemistry in vivo approach in order to look for proteins able to bind to a chimeric RNA headed by the 5UTR of rbcL messenger. Alive cells of C. reinhardtii were irradiated with UV light and the RNA-proteins aducts were purified. The associated proteins were analyzed by MS/MS spectroscopy. Among the identified proteins, PDI and RB38 could be pointed proteins because, both of them, has been described in a ribonucleoprotein complex with affinity by the 5UTR of the psbA chloroplast messenger. We have corroborated the in vitro affinity of both proteins, in an independent way, to the 5 UTR of rbcL. These proteins could be promising because, through them, we can propose new approaches to determine the specific protein involved in the regulation of the rbcL mRNA stability.