Role of metallochaperones in iron and copper trafficking in Symbiotic Nitrogen Fixation

Transition metals, such as copper and iron, are essential nutrients acting as cofactors of key metalloenzymes involved in Symbiotic Nitrogen Fixation (SNF). Therefore, both copper and iron deficiencies result in a diminished SNF. Once these nutrients are incorporated into the nodule cells through specific metal transporters, they must be bound to acceptor molecules, rather than being free, hydrated in solution, as they can catalyze toxic Fenton-type reactions and displace essential elements from the active site in metalloenzymes. To prevent it, cells use intermediate proteins, metallochaperones, that shuttle metals from their transporters to their specific acceptor proteins or to the different subcellular compartments. The importance of copper in SNF is underlined by the existence of nodule-specific copper delivery systems, such as the Cu+-transporter COPT1. Hence, it is expected that the unique set of copper proteins present in nodules includes at least one specific Cu+-chaperone to provide them the cofactor. In this Thesis, we propose that MtNCC1 plays this role. MtNCC1 N-terminal domain presents the classic Cu+-chaperone fold, with a CXXC motif that coordinates copper with pico-molar affinity. This gene is specifically expressed in nodules, mainly in the zones where the symbiosis is being established and nitrogenase is expressed. At subcellular level, MtNCC1 is located in the cytosol, associated to plasma and symbiosome membranes, and within nuclei of infected and non-infected cells. KO mutant line ncc1 shows a significant reduction in both copper-dependent cytochrome c oxidase and nitrogenase activities. In addition, a subset of the copper-proteome is altered in the mutant nodules. To identify which proteins would accept copper by interacting with MtNCC1, a pull-down assay using Cu+-loaded N-terminal MtNCC1 as bait was performed. As a result, new putative Cu-proteins have been uncovered proposing new functions for copper in SNF. In contrast, no iron-chaperone has been identified in plants to date. However, the large amounts of iron required for nodulation and its essential role as cofactor of the nitrogenase complex, suggest that iron-chaperones should be acting in nodules. In this work, a KH-domain containing protein, Mt080, has been identified in M. truncatula nodules. This protein is able to bind Fe2+, as well as interact with plasma membrane NRAMP1 transporter in iron-dependent manner. Based on these results, we propose that Mt080 protein could fulfil the iron-chaperone role in nodules. RESUMEN Los metales de transición, como el cobre y el hierro, son nutrientes esenciales que actúan como cofactores de enzimas clave involucradas en la Fijación Simbiótica de Nitrógeno (FSN). De esta forma, tanto las deficiencias de cobre como de hierro resultan en una disminución de la FSN. Una vez que estos nutrientes son incorporados a las células del nódulo a través de transportadores específicos de metales, deben unirse a moléculas aceptoras, ya que en su forma libre, hidratados en solución, pueden catalizar reacciones tóxicas de tipo Fenton y desplazar elementos esenciales del sitio activo en otras metaloenzimas. Para prevenir esto, las células usan proteínas intermediarias, metalochaperonas, que median la entrega de los metales desde sus transportadores hasta sus proteínas aceptoras específicas o a los diferentes compartimentos subcelulares. La importancia del cobre en la FSN queda resaltada por la existencia de sistemas de transporte de este metal específicos del nódulo, como el transportador de Cu+ COPT1. Por lo tanto, se espera que el conjunto único de proteínas de cobre presente en el nódulo incluya al menos una Cu+-chaperona específica para proporcionarles el cofactor. En esta Tesis, proponemos que MtNCC1 desempeña este papel. El dominio N-terminal de MtNCC1 presenta la estructura clásica de una Cu+-chaperona, con un motivo CXXC que coordina cobre con afinidad de pico-molar. Este gen se expresa específicamente en nódulos, principalmente en las zonas donde se establece la simbiosis y se sintetiza la nitrogenasa. A nivel subcelular, MtNCC1 se localiza en el citosol, asociada a la membranas plasmática y del simbiosoma, y dentro de los núcleos de células infectadas y no infectadas. La línea mutante knock out ncc1 muestra una reducción significativa en la actividad citocromo-c-oxidasa dependiente de cobre y en la actividad nitrogenasa. Además, un subconjunto del proteoma de cobre está alterado en los nódulos mutantes. Para identificar qué proteínas aceptarían cobre al interactuar con MtNCC1, se realizó un ensayo de pull-down utilizando el dominio N-terminal de MtNCC1 cargado con Cu+ como cebo. Como resultado, se han revelado nuevas proteínas putativas de cobre, proponiendo así nuevas funciones del cobre en la FSN. En contraste, en plantas, no se ha identificado hasta la fecha ninguna chaperona de hierro. Sin embargo, la gran cantidad de hierro requerida para la nodulación, sumado al hecho de ser un cofactor crucial del complejo nitrogenasa, sugiere que las chaperonas de hierro deberían estar actuando en los nódulos. En este trabajo, se ha identificado una proteína que contiene dominios KH, Mt080, en los nódulos de M. truncatula. Esta proteína es capaz de unir Fe2+, así como de interactuar con el transportador de membrana plasmática NRAMP1 de manera dependiente de hierro. Basándonos en estos resultados, proponemos que Mt080 podría ejercer el papel de chaperona de hierro en el nódulo.