The role of IL-12 in the pathogenesis of endometrosis in mare

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de Morfologia e Função

ABSTRACT - THE ROLE OF IL-12 IN THE PATHOGENESIS OF ENDOMETROSIS IN MARE - Equine endometrosis is a chronic degenerative uterine condition. It is characterized by fibrotic processes developing around the endometrial glands and stroma, in which the involved processes can be active or inactive. The severity of endometrial fibrosis is graded according to four categories: Category I (no fibrosis), followed by IIA, IIB, and III, which indicate mild, moderate, and severe fibrosis and inflammation. Endometrosis is a significant contributor to mare infertility, resulting in financial loss for horse owners globally, including those in Portugal. Although the pathogenesis of endometrosis is multifactorial, our study specifically investigated the potential role of interleukin (IL)-12. In a recent study, which focused on transcriptomic profiling of mare endometrium, changes in the expression of genes associated with interleukin (IL)-12 signaling and production in fibroblasts at different stages of endometriosis were demonstrated, identifying IL-12 as a potential player in the development of endometrial fibrosis. Interleukin 12 is a proinflammatory cytokine synthesized and released by macrophages, monocytes, dendritic cells, and B cells that participates in both cellular and humoral immune responses. This cytokine is composed of two covalently linked subunits (IL-12a(p35) and IL-12b(p40)). The purpose of the current study was to: (i) evaluate the mRNA expression of IL-12 subunits (IL-12p35, IL-12p40) and its receptors (IL-12RBeta1 e IL-12RBeta2), in mare endometria (n=77) from categories I, IIA, IIB, and III at the mid-luteal phase (MLP) and follicular phase (FP) of the estrous cycle; as well as (ii) the effect of IL-12 on the mRNA expression of fibrotic markers, such as: collagen COL1A1 and COL3A1, fibronectin (FN1), lysyl oxidase like 2 (LOXL2), α-smooth muscle actin (α-SMA), matrix metalloproteinases (MMP) 2, 3 and 9, and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)1 and 2 in endometrial fibroblasts (n=6); and (iii) the effect of IL-12 on fibroblast proliferation (n=6). Real-time PCR was performed on endometrial samples to determine mRNA expression of IL-12 components and receptors. The transcriptional evaluation of fibrotic markers was performed by qPCR in endometrial explants after the treatment with IL-12 (10 ng/ml) for 48 and 96h. In Category IIB endometria, the mRNA expression of IL-12RBeta2 was up-regulated in the MLP, compared to FP of the estrous cycle, and IL-12 treatment increased COL1A1, COL3A1,Alfa-SMA, MMP3, and -9 mRNA expression in mare endometrial fibroblasts cultured in vitro after 96h (p<0.05). Moreover, fibroblast proliferation was decreased in response to IL-12 treatment after 96h (P<0.001). The findings from the current study indicate that IL-12 has a direct impact on the expression of fibrotic markers in endometrial fibroblasts and fibroblast proliferation. It suggests a correlation between IL-12 and endometrosis development through the increased ECM components and MMP expression associated with fibrogenesis

RESUMO - O PAPEL DA INTERLEUCINA-12 NA PATOGENESE DA ENDOMETROSE NA ÉGUA - A endometrose equina é uma doença uterina de carácter degenerativo e crónico. É caracterizada pela acumulação de fibras de colagénio que se desenvolvem ao redor das glândulas endometriais e no estroma, em que os processos envolvidos podem ser ativos ou inativos. A gravidade da fibrose endometrial é classificada de acordo com quatro categorias: categoria I (sem fibrose), seguida por IIA, II B e III, que indicam fibrose e inflamação leve, moderada e grave. A endometrose contribui significativamente para a infertilidade das éguas, resultando em perdas financeiras para os proprietários de cavalos em todo o mundo, incluindo em Portugal. Embora a patogénese da endometrose seja multifatorial, este estudo investiga especificamente a potencial influência da interleucina (IL)-12. Num estudo recente, que se concentrou no perfil transcriptómico do endométrio de éguas, foram demonstradas alterações na transcrição de genes associados à sinalização e produção de interleucina (IL) -12 por fibroblastos em diferentes estágios da endometrose, identificando a IL-12 como um potencial ator no desenvolvimento de fibrose endometrial. A interleucina 12 é uma citocina pró-inflamatória sintetizada e liberada por macrófagos, monócitos, células dendríticas e células B, que participa nas respostas imunitárias celulares e humorais. Esta citocina é constituída pelas subunidades IL-12a (IL-12p35) e IL-12b (IL-12p40), ligadas covalentemente. Os objetivos do presente estudo foram: (i) avaliar a transcrição de mRNA das subunidade da IL-12 e seus receptores (IL-12p35, IL-12p40, IL-12RBeta1 e IL-12RBeta2), em endométrios (n = 77) das categorias I, IIA, IIB e III na fase lútea média (MLP) e na fase folicular (FP) do ciclo éstrico, bem como (ii) o efeito da IL-12 na transcrição do mRNA de marcadores fibróticos, tais como: o colagénio (COL1A1 e COL3A1), a fibronectina (Fn1), a lisil oxidase-like 2 (Loxl2), a α-smooth muscle actin (α-Sma), as metaloproteinases de matriz (MMP) 2, 3 e 9, e os inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMP) 1 e 2 em fibroblastos endometriais (n=6); e (iii) o efeito da IL-12 na proliferação dos fibroblastos (n=6). Para a medição da transcrição de mRNA dos componentes e recetores da IL-12, foi realizado qPCR em amostras de endométrio. A avaliação da transcrição dos marcadores de fibrose foi realizada por qPCR em explantes de endométrio após tratamento com IL 12 (10 ng/ml) durante 48 e 96h. Nos endométrios classificados como categoria IIB, a transcrição de IL 12R-2 revelou-se aumentada na fase lútea, comparando com a fase folicular, e o tratamento de 96h com IL-12 aumentou a transcrição de mRNA de COL1A1, COL3A1, α -SMA, MMP3 e -9 nos fibroblastos endometriais provenientes de culturas in vitro (p<0.05). Além disso, a proliferação de fibroblastos diminuiu em resposta ao tratamento com IL-12 após 96h (P<0.001). Os resultados do presente estudo indicam que a IL-12 tem um impacto direto na transcrição de marcadores fibróticos em fibroblastos endometriais e na sua proliferação. Por conseguinte, propomos uma correlação entre a IL-12 e a endometrose através do aumento dos componentes da MEC e da transcrição de MMP associada à fibrogénese

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