Desarrollo y evaluación toxicológica de nuevos materiales para su aplicación en la conservación de alimentos.

En la actualidad, la industria alimentaria está apostando por la incorporación de sustancias naturales a envases alimentarios con el fin de incrementar la perdurabilidad del alimento en el mercado. Debido al empleo de estas sustancias en esta nueva aplicación, la seguridad de los consumidores y del medio ambiente puede verse comprometida debido a una mayor exposición, desconociéndose en gran medida, hasta el momento, las posibles consecuencias. De entre las sustancias naturales seleccionadas por la industria alimentaria para este fin, destacan las arcillas y minerales de arcillas, y los aceites esenciales y sus respectivos componentes mayoritarios, constituyendo las primeras (arcillas) el principal objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral. Por todo ello, decidimos realizar una evaluación toxicológica mediante una batería de ensayos tanto in vitro como in vivo, para investigar los posibles efectos tóxicos que pueden desencadenarse tras la exposición a estas sustancias, tanto puras como ya incorporadas en el envase. La relevancia de la información toxicológica de estas sustancias es tal que constituye un requisito reglamentario por parte de las autoridades competentes antes de su comercialización. En el caso de las arcillas y minerales de arcilla, se ha demostrado una mejora de las propiedades mecánicas, térmicas y barrera de las matrices poliméricas debido a su incorporación, lo que está, íntimamente relacionado con el incremento de la vida útil de los alimentos. Con el fin de contextualizar la situación ante la que se encontraban las arcillas y sus derivados en el área del envasado de la industria alimentaria y así abordar posteriores estudios, nos pareció importante realizar una exhaustiva revisión bibliográfica sobre los datos de toxicidad publicados en la literatura científica hasta la actualidad. La disparidad de los resultados disponibles hasta el momento hace necesaria una evaluación toxicológica caso por caso. Diferentes parámetros pueden estar involucrados en la respuesta obtenida, incluyendo: (i) condiciones de exposición tales como concentraciones seleccionadas o tiempos ensayados; (ii) modelos experimentales elegidos; (iii) modificadores o surfactantes incorporados a la estructura de la arcilla, (iv) sensibilidad de los ensayos llevados a cabo, etc. Dicha revisión bibliográfica ha dado lugar a la siguiente publicación: •TOXICOLOGICAL EVALUATION OF CLAY MINERALS AND DERIVED NANOCOMPOSITES: A REVIEW. (Maisanaba y col., 2015; Environmental Research 138, 233-254). La vía de exposición más importante en el contexto que nos engloba es la vía oral, dado que las arcillas van a ser incorporadas a un envase que posteriormente se va a poner en contacto con un alimento, y éste último será ingerido por los consumidores. En este caso los órganos que principalmente se podrían ver afectados serán los que componen el sistema digestivo, destacando entre ellos el intestino, encargado de la absorción de nutrientes, y el hígado, crucial en la biotransformación de xenobióticos. Se llevó a cabo una batería de ensayos de los materiales objeto de estudio con el fin de esclarecer sus principales efectos tóxicos, teniendo en cuenta la escasez y disparidad de los datos disponibles. Las líneas celulares seleccionadas fueron una línea celular de hepatoma humano (HepG2) y una línea celular de adenocarcinoma de colon (Caco-2). Éstas fueron expuestas a diversas arcillas no modificadas y modificadas con sales de amonio cuaternario, tanto comercializadas (Cloisite®Na+ (CNa+), Cloisite®20A (C20A) y Cloisite®30B (C30B)) o desarrolladas por el Instituto Tecnológico de Embalaje, Transporte, y Logística (ITENE) de Valencia (Clay1 y Clay2). Los experimentos llevados a cabo incluyeron la evaluación de: citotoxicidad basal, análisis de la morfología celular, genotoxicidad (ensayo cometa y ensayo de micronúcleos (MN)) y estrés oxidativo (producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y contenido de glutatión (GSH)). De forma general se obtuvo ausencia de toxicidad en el caso de las arcillas CNa+, C20A y Clay1, y sólo en el caso de la primera arcilla mencionada se obtuvo una inducción de MN significativa y alguna alteración de la morfología celular. Sin embargo, pudimos observar daño en ambas líneas celulares tras la exposición a C30B y Clay2 en la mayoría de los parámetros evaluados. Además, se ha llevado a cabo por primera vez en la línea celular HepG2 el estudio de la influencia de las arcillas en la modulación de la expresión génica de un extenso grupo de genes involucrados en activación/destoxicación y otros mecanismos de acción tóxica. CNa+ y Clay2 sí demostraron alterar la regulación de distintos genes, no así C30B y Clay1. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •IN VITRO TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF CLAYS FOR THEIR USE IN FOOD PACKAGING APPLICATIONS. (Maisanaba y col., 2013, Food and Chemical Toxicology 37, 266-275). •GENETIC POTENTIAL OF MONTMORILLONITE CLAY MINERAL AND ALTERATION IN THE EXPRESSION OF GENES INVOLVED IN TOXICITY MECHANISMS IN THE HUMAN HEPATOMA CELL LINE HEPG2. (Maisanaba y col., 2015; Journal of Hazardous Materials (en revision/ under revision)). •INDUCTION OF MICRONUCLEI AND ALTERATION OF GENE EXPRESSION BY AN ORGANOMODIFIED CLAY IN HEPG2 CELLS. (Maisanaba y col., 2015; Archives of Toxicology (en revisión/ under revision)). •EFFECTS OF TWO ORGANOMODIFIED CLAYS INTENDED TO FOOD CONTACT MATERIALS ON THE GENOMIC INSTABILITY AND GENE EXPRESSION OF HEPATOMA CELLS. (Maisanaba y col., 2015); Toxicology Letters (en revision/ under revision). •TOXIC EFFECTS OF A MODIFIED MONTMORILLONITE CLAY ON THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Applied Toxicology 34, 714-725). •TOXICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS USED IN FOOD CONTACT MATERIALS ON HUMAN TARGET CELL LINES. (Houtman y col., 2014; Applied Clay Science 90, 150-158). Aunque los órganos y tejidos del sistema digestivo serían probablemente los más afectados por exposición a las arcillas, hay otras dianas que también podrían verse dañadas, destacando el tejido endotelial vascular, involucrado en la distribución y absorción. Hasta el momento los datos disponibles acerca de los efectos de este modelo experimental expuesto a arcillas son limitados. Por ello, se ha llevado a cabo la evaluación de la viabilidad de la línea celular endotelial de vena umbilical humana (HUVEC) expuestas a CNa+, C30B, Clay1 y Clay2. Los resultados obtenidos indicaron que las células HUVEC seguían un patrón de respuesta muy similar al de HepG2 y Caco-2 ante la exposición a las arcillas, presentando una sensibilidad parecida a la línea celular hepática. Además, el estudio del potencial mutagénico mediante el Test de Ames es una prueba exigida antes de la comercialización de cualquier producto que vaya a entrar en contacto con alimentos (EFSA 2011b, 2015), siendo en este caso necesaria la evaluación de las arcillas que estén destinadas a ser incorporadas al envasado alimentario. El modelo experimental seleccionado fue Salmonella typhimurium (5 cepas), el cual se expuso a las cuatro arcillas mencionadas, en ausencia y presencia de fracción metabólica externa. Únicamente pudimos observar una respuesta mutagénica positiva en el caso de C30B y Clay1. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY ASSESSMENT OF ORGANOMODIFIED CLAYS POTENTIALLY USED IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2015; Toxicology In Vitro 29, 1222-1230).La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) no sólo propone la evaluación de los materiales que se incorporan a las matrices poliméricas de envasado, sino también, siendo incluso de mayor importancia, la evaluación de los envases resultantes (EFSA, 2011a,b). En este sentido, ITENE desarrolló dos materiales nanocompuestos basados en ácido poli(láctico) (PLA) y Clay1/Clay2, ambas arcillas diseñadas por ellos. Con estos materiales se llevaron a cabo ensayos de migración, utilizando como simulante alimentario agua destilada, aceptado por el Reglamento UE Nº 10/2011 dado el tipo de alimentos hacia los que van dirigidos los mismos (hidrófilos). Una vez obtenidos los extractos de migración de PLA-Clay1 y PLA-Clay2, se evaluaron distintos parámetros con el fin de determinar los posibles efectos tóxicos debido a la migración de las arcillas tras la exposición a los mismos. En este sentido, se evaluó la viabilidad celular de HepG2 y Caco-2 expuestas a ambos extractos, así como el potencial mutagénico de los mismos mediante el Test de Ames. En los ensayos llevados a cabo se observó la ausencia de citotoxicidad y mutagenicidad en las condiciones ensayadas. Por otro lado, teniendo en cuenta que la presencia de los metales mayoritarios de la estructura de las arcillas son Al, Ca, Fe, Mg y Si, se evaluó el contenido de los mismos en los extractos de migración mediante Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente (ICPMS) y Espectroscopía de Plasma Inductivo acoplado a Espectroscopía de Emisión Óptica (ICP-OES), no obteniéndose diferencias significativas con respecto al grupo control. Estos resultados se recogen en la siguiente publicación: •CYTOTOXICITY AND MUTAGENICITY STUDIES ON MIGRATION EXTRACTS FROM NANOCOMPOSITES WITH POTENTIAL USE IN FOOD PACKAGING. (Maisanaba y col., 2014 Food and Chemical Toxicology 66, 366-372). Una vez realizado el estudio toxicológico in vitro de las arcillas y considerando las mejoras tecnológicas presentadas por los polímeros nanocompuestos resultantes, se seleccionó la arcilla de mejor perfil toxicológico y tecnológico, siendo en este caso Clay1 la seleccionada para continuar la investigación. Con el fin de completar los resultados obtenidos in vitro y dada la escasez de información in vivo, se realizó un ensayo de toxicidad subcrónica durante 90 días en ratas Wistar expuestas a Clay1 (40 mg/kg/día) en la dieta y su extracto de migración (PLA-Clay1) como agua de bebida (ad libitum). En este sentido, transcurrido el periodo de exposición, los animales fueron sacrificados y se extrajeron sus órganos (hígado, riñón, intestino, cerebro, corazón, testículos, pulmones y bazo) y sangre mediante punción cardiaca. Se evaluaron una serie de parámetros, incluyendo: análisis histopatológico de todos los tejidos, bioquímica clínica del suero sanguíneo, liberación de interleucina 6 (IL-6), biomarcadores involucrados en la respuesta del posible estrés oxidativo generado en hígado y riñón, tales como la ratio glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG), peroxidación lipídica (LPO), y actividades de enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión–S-transferasa (GST). Además, la expresión génica y abundancia proteica de SOD y CAT en hígado y riñón también fueron evaluadas. Podemos destacar un aumento de la actividad de CAT en riñón, así como de expresión génica y abundancia proteica, observado tras la exposición a Clay1. El resto de los marcadores evaluados tras la exposición a la arcilla o al extracto no se vieron afectados. Por otro lado, nos pareció interesante evaluar el contenido de los metales característicos de la composición de la arcilla en bazo de ratas expuestas a la arcilla y el extracto, no hallando diferencias notables con respecto a las ratas controles. Los resultados obtenidos en estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: •EFFECTS OF THE SUBCHRONIC EXPOSURE TO AN ORGANOMODIFIED CLAY MINERAL FOR FOOD PACKAGING APPLICATIONS ON WISTAR RATS. (Maisanaba y col., 2014; Applied Clay Science 95, 37-40). •IN VIVO EVALUATION OF ACTIVITIES AND EXPRESSION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN WISTAR RATS EXPOSED FOR 90 DAYS TO A MODIFIED CLAY. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,456-466). •IN VIVO TOXICITY EVALUATION OF THE MIGRATION EXTRACT OF AN ORGANOMODIFIED CLAY-POLY(LACTIC) ACID NANOCOMPOSITE. (Maisanaba y col., 2014; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues 77,731-446). •EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD DE UNA ARCILLA MODIFICADA Y SU EXTRACTO DE MIGRACIÓN EN BAZO DE RATAS WISTAR EXPUESTAS DE FORMA SUBCRÓNICA. (Maisanaba y col., 2013 Revista de Toxicología 30, 125- 130). Para la realización de esta Tesis Doctoral, la doctoranda realizó una estancia de investigación en ITENE, bajo la dirección de las Dras. Susana Aucejo y María Jordá, en la que se abordaron varios objetivos. Durante la estancia, se llevó a cabo el desarrollo de nuevas arcillas basadas en CNa+ modificadas con silanos, Clay3, Clay4A y Clay4B, destinadas al envasado. La caracterización de las mismas se realizó por espectroscopía de infrarrojos (FTIR), difracción de rayos X y termogravimetría (TGA). Los resultados preliminares mostraron una buena incorporación de los modificadores y mejoraron el perfil tecnológico de la arcilla original no modificada. Posteriormente, se evaluó la toxicidad de las tres arcillas sintetizadas. Los biomarcadores estudiados incluyeron citotoxidad basal, genotoxicidad (mediante el ensayo cometa) y estrés oxidativo (producción de ERO y contenido de GSH) en las líneas HepG2 y Caco-2. Por otro lado, también se determinó mediante citometría de flujo el posible mecanismo de muerte celular de células Caco-2 expuestas a Clay4A y Clay4B. Además, se evaluó el potencial mutagénico de las arcillas mediante el Test de Ames. De forma general, los resultados preliminares dieron lugar a una ausencia de efectos tóxicos por parte de Clay3, sin embargo, tanto Clay4A y Clay4B mostraron toxicidad en la mayoría de los parámetros ensayados. Dado que Clay3 fue la arcilla con mejor perfil tecnológico y toxicológico ésta fue seleccionada para realizar ensayos de vida útil, observándose un incremento de aproximadamente 24h en comparación con el control. Por otro lado, se valoró la migración de metales (Al, Ca, Fe, Mg y Fe) en dos simulantes diferentes, etanol al 10% e isooctano, procedentes de materiales nanocompuestos de polipropileno (PP) más Clay3 o PP-Clay4A. En todos los casos se obtuvieron diferencias con el control en alguno de los metales determinados. Los resultados obtenidos en estos experimentos darán lugar a diferentes publicaciones, aún pendientes de envío: •DEVELOPMENT, CHARACTERIZATION AND CYTOTOXICITY OF NOVEL SILANES MODIFIED CLAYS INTENDED TO PACKAGING (Título provisional). •TOXICITY EVALUATION OF A NEW SILANE-MODIFIED CLAY AND ITS MIGRATION EXTRACT FROM A NANOCOMPOSITE INTENDED TO FOOD PACKAGING (Título provisional). •TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF TWO SILANE-MODIFIED CLAYS IN HUMAN HEPATOMA CELLS AND SALMONELLA TYPHIMURIUM STRAINS (Título provisional). •CYTOTOXICITY, OXIDATIVE STRESS AND GENOTOXICITY ASSAYS OF SILANES-MODIFIED CLAYS IN THE HUMAN INTESTINAL CELL LINE CACO-2 (Título provisional). En relación a los aceites esenciales y sus componentes mayoritarios, también éstos están teniendo un gran auge en la industria alimentaria, empleándose en un nuevo tipo de envasado conocido como envasado activo. En este sentido, en vez de dar lugar a mejoras tecnológicas en sí como en el caso de las arcillas, lo que se aprovecha de estos aceites y sus componentes es su potencial antioxidante y antimicrobiano natural. Sin embargo, debe ser establecido un rango de concentraciones seguro para evitar los posibles efectos contraproducentes que puedan desencadenarse por un abuso de los mismos. En primer lugar, vimos necesario realizar una contextualización del uso actual de este tipo de envasado y las propiedades antimicrobianas y antioxidantes que presentan, así como una revisión de los principales efectos citotóxicos en diferentes líneas celulares de origen humano. Dicha revisión ha dado lugar a la presente publicación: •NEW ADVANCES IN ACTIVE PACKAGING INCORPORATED WITH ESSENTIAL OILS OR THEIR MAIN COMPONENTS FOR FOOD PRESERVATION. (Maisanaba y col., 2015. Food Reviews International (en revisión, under revision). Por último, la evaluación de los componentes mayoritarios de los aceites esenciales antes de ser incorporados a los envases es también obligatoria, tal y como establece la EFSA (EFSA, 2011b). En este sentido, el aceite esencial de orégano es uno de los más utilizados por sus destacadas propiedades antimicrobianas, siendo timol y carvacrol sus dos componentes mayoritarios. Existen en la bibliografía resultados sobre sus perfiles genotóxicos obtenidos por otros autores (Azizan y Blevins, 1995; Stammati y col., 1999; Ipek y col., 2005; Buyukleyla y Recuzogullari, 2009; Llana-Ruíz-Cabello y col., 2014). Estos resultados son dispares en algunos aspectos, siendo necesaria una evaluación de su toxicidad más amplia con el fin de esclarecer el perfil genotóxico de estos dos compuestos mayoritarios. Por consiguiente nos pareció interesante llevar a cabo el ensayo de MN, y, por primera vez, elensayo de Linfoma de Ratón. Los resultados obtenidos no mostraron una relevancia biológica notable para ninguno de los compuestos bajo las condiciones ensayadas. Dichos resultados se reflejan en la siguiente publicación: •IN VITRO GENOTOXICITY TESTING OF CARVACROL AND THYMOL USING THE MICRONUCLEUS AND MOUSE LYMPHOMA ASSAYS. (Maisanaba y col., 2015; Mutation Research 784-785, 37-44).

Premio Extraordinario de Doctorado US